不脫鈣骨及種植體骨磨片不同染色方法的選擇與應用*

王東勝 呂 燕 王 興

對于采用骨粉、骨支架材料修復骨缺損，以及觀察人工種植牙修復結果的研究中，不脫鈣骨磨片技術是必要的檢測手段。此方法自上世紀80 年代以來，得到了廣泛的應用。本實驗室自上世紀九十年代開始利用此項技術，經過不斷的探索，已應用于各類骨缺損修復的實驗研究，以及人工種植牙與骨結合的研究中[1]。

但在我們應用的過程中發(fā)現，許多實驗者對于采用不脫鈣骨磨片的具體應用范圍還不明確，特別是制成磨片后采用哪種染色方法可以得到較理想的實驗觀測結果，了解就更少。文獻對此類問題也無較全面闡述。針對于此，我們對在本實驗室2010年-2015 年所制作的100 張磨片中，對其所應用的修復材料以及采用的染色方法進行了對比分析，就不同的實驗目的、材料，應該采用哪種染色方法進行了研究，以期對于此類研究者在染色方法的選擇上提供參考。

1. 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 設備及材料 EXAKT 300 CP 骨組織切割機(EXAKT 公司，德國)；EXAKT 400 CS/AW 骨組織磨片機(EXAKT 公司，德國)；EXAKT E520 光固化包埋機(EXAKT 公司，德國)；K320磨盤紙(EXAKT 公司，德國)；P800 磨盤紙(EXAKT 公司，德國)；K1200 磨盤紙(EXAKT 公司，德國)；K4000 磨盤紙(EXAKT 公司，德國)。

1.1.2 標本 比格犬，兔，大鼠的下頜骨、股骨等骨缺損術后，或人工種植體植入后。實驗方法為選取在本實驗室制作磨片中分別采用納米羥基磷灰石復合材料修復骨缺損，β-磷酸三鈣支架材料修復骨缺損，Bio-oss 骨粉修復骨缺損，帶人工種植牙骨組織等多種實驗的標本。

1.1.3 試劑 甲苯胺藍染色液；亞甲基藍-酸性品紅染色液；Goldner’s 三色法染色液。

1.2 方法

1.2.1 組織取材與處理 組織采用EXAKT 300CP 骨組織切割機將骨組織修切成小塊，采用中性福爾馬林固定。

1.2.2 組織脫水與包埋 取分切后的組織塊經梯度酒精脫水，氯仿透明，三次浸潤液浸泡，最后用EXAKT E520 光固化包埋機包埋[2]。

1.2.3 切割與磨片 采用EXAKT 300 CP 骨組織切割機將骨組織包埋塊切為200μm 厚的薄切片，再用EXAKT 400 CS/ AW 骨組織磨片機，經K320、P800、K1200、K4000 等不同目數的磨盤紙打磨切片，最終磨成25-30μm 厚的磨片。

1.2.4 染色 主要采用Goldner’s 三色法[1，3]、甲苯胺藍[4]和亞甲基藍-酸性品紅[1，5]等三種特殊染色法進行染色。每張磨片只能使用一種染色方法，具體采用哪種方法染色，根據實驗目的來確定。

1.2.5 鏡下觀察 選取按以上方法處理的磨片，在正置顯微鏡下觀察對比不同染色方法的適用范圍。

2. 結果

2.1 帶有Bio-oss 骨粉的骨磨片染色 觀察帶有Bio-oss 骨粉修復骨缺損組織磨片的三種染色方法，染色結果對比，以甲苯胺藍法染色法為最佳(見圖1)。

圖1 利用Bio-oss 骨粉修復骨缺損后磨片三種染色(100 倍)

2.2 采用β-磷酸三鈣支架材料修復骨缺損的染色 結果顯示Goldner’s 三色法染色可以更清晰的觀察新生骨生成的層次與過程，同時若輔助以亞甲基藍-酸性品紅染色法，能更全面的得到實驗結果(見圖2-1，2-2，2-3)。

圖2-1 β-磷酸三鈣支架材料修復骨缺損磨片三種方法染色(40 倍)

圖2-2 β-磷酸三鈣支架材料修復骨缺損磨片三種方法染色(100 倍)

圖2-3 β-磷酸三鈣支架材料修復骨缺損磨片三種方法染色(200 倍)

2.3 采用羥基磷灰石復合材料修復骨缺損成骨實驗的染色結果 顯示對于類似于這種細顆粒多層支架修復材料來說，成骨是大面積散在的，染色方法應能清晰準確的顯示結果，比較后發(fā)現，亞甲基藍-酸性品紅染色法較適合于此類研究(見圖3-1，3-2)。

圖3-1 羥基磷灰石復合材料修復骨缺損磨片三種方法染色(40 倍)

圖3-2 羥基磷灰石復合材料修復骨缺損磨片三種方法染色(100 倍)

2.4 顯示新骨形成的骨磨片染色 通過對比亞甲基藍-酸性品紅染色法和甲苯胺藍等兩種染色方法，以甲苯胺藍法為最好，新生骨和成熟骨界限清楚，對比明顯(見圖4)。

圖4 顯示區(qū)分新生骨與成熟骨的染色方法

2.5 觀察種植體骨結合人工種植體植入實驗的染色 結果顯示，亞甲基藍-酸性品紅染色法能更清晰地反映種植體與骨結合的邊界和數量，更有利于計算成骨面積(見圖5)。

圖5 顯示種植體骨結合的染色方法

2.6 同時觀察軟組織及骨的骨磨片染色 結果表明亞甲基藍-酸性品紅染色法能清晰的顯示粘膜、纖維及骨組織(見圖6)。

圖6 同時觀察軟組織及骨組織的磨片染色方法

3. 討論

對于人工種植牙、帶熒光標記的骨組織、陶瓷材料以及β-磷酸三鈣等材料進行骨缺損修復實驗的標本，因其材料的特殊性，不脫鈣骨組織磨片是必要的研究手段。在成功制作好骨磨片后，究竟選擇哪種或哪幾種染色方法來顯示實驗結果成為一個關鍵問題。

本實驗室在近20 年的實驗研究中，特別是近幾年來，采用德國EXAKT 公司生產的切磨系統(tǒng)制作骨組織磨片后，對制作好的磨片選擇哪種染色方法進行了深入的研究。從各種材料的染色結果中可以看出，不同的實驗，因其實驗目的的不同，選擇材料的不同，實驗終結時反映在組織上的結果也是不同的。

對于骨缺損修復支架材料來說，比較常用的基礎材料是Bio-oss 骨粉，β-磷酸三鈣，羥基磷灰石，只是實驗者對其進行一些改性或添加一些復合物，以提高其成骨的效能[6，7]。

Bio-oss 骨粉是口腔科臨床常用的成骨材料，作為實驗的陽性對照材料來使用，其成骨過程是材料不斷降解新骨不斷生成，新骨將材料包圍最終全部轉化為骨組織。從圖1 中可以看到，Goldner’s三色法、甲苯胺藍和亞甲基藍-酸性品紅等三種染色法的染色結果，亞甲基藍-酸性品紅染色后，新生的骨組織包圍著骨粉，但新生骨的成骨過程不如甲苯胺藍法更清楚，Goldner’s 三色法材料與新骨的顏色有些接近，且骨細胞顯示不如以上兩種明顯。通過對比后可以看出對于使用Bio-oss 骨粉修復骨缺損的實驗，甲苯胺藍法染色結果最能達到實驗的效果，可以觀察到材料降解，以及新骨是如何形成的等多種結果。如經費允許，還可以再輔以亞甲基藍-酸性品紅染色，但不建議采用三色法。

β-磷酸三鈣也是口腔、骨科和整形外科常用的骨缺損修復材料[8]，從圖2-1 到2-3 不同放大比例結果來看，Goldner’s 三色法的顯示結果是，礦化骨和膠原：藍色；類骨質：紅色；胞質：橙色。是三種染色法中最能反映采用β-磷酸三鈣支架材料后，骨形成與修復過程的染色方法，從圖中可以清楚的顯示骨形成的層次和順序。但因三色法骨細胞為桔紅色，不清晰，最好再輔以亞甲基藍-酸性品紅染色，其紅色骨與藍色的成骨細胞和破骨細胞對比明顯。

羥基磷灰石是使用歷史比較長的骨修復支架材料，現在所使用的多是在原有基礎上的改性或添加骨生長因子的復合材料[9]。從圖3 中可以看出對于類似這種顆粒層狀支架材料來說，其成骨是以散在的片狀形式出現，新骨包繞材料生長。三種染色對比發(fā)現，亞甲基藍-酸性品紅染色法效果最好，甲苯胺藍法中材料與新骨對比更明顯。在此類研究中，這兩種染色方法可以對照來使用。

對于支架材料植入后新骨是否生長，生成了多少新生骨，從圖4 的甲苯胺藍法中可以清楚的看到新生骨與成熟骨的邊界，但亞甲基藍-酸性品紅染色法則界限不清。對于人工種植體植入后，種植體與骨結合的情況及面積測量，從圖5 中可以清楚的看到，亞甲基藍-酸性品紅染色法更有優(yōu)勢，在僅是觀察種植體骨結合的實驗中，建議采用此種染色法。在有些種植體植入實驗中，同時要觀察軟組織及骨組織時，比如牙齦組織、粘膜、纖維等。從圖6 中也可以看到，亞甲基藍-酸性品紅染色法能清晰的觀察粘膜、纖維和牙齦組織，其他兩種方法比較模糊，不適合此種研究。

[1] 王東勝，劉洪臣.帶種植體骨磨片技術[J].中華老年口腔醫(yī)學雜志，2009，7(6)：360-362

[2] 王東勝，路正剛. 種植體骨界面組織形態(tài)學研究方法探討[J].中華老年口腔醫(yī)學雜志，2005，3(3)：142-144

[3] Cruber Helen E. Adaptation of Goldner’s Masson Trichrome stain for the study of undecalcified plastic embedded bone[J].Biotechnic Histochemistry， 1992，67(1)30-34

[4] 廖二元，譚利華. 代謝性骨病學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：279-283

[5] Doneth K， Breuner G. A method for the study of undecadcified bones and teeth with attached tissues-The sige-Schliff technique[J]. J Oral Pathol，1982，11:318-326

[6] 趙 錚，趙春雨.骨組織工程應用于口腔頜面部骨組織缺損修復研究進展[J].繼續(xù)醫(yī)學教育，2015，29(9)：77-79

[7] 張朕坡，張正文.組織工程骨修復下頜骨缺損研究進展[J].中華實用診斷與治療雜志，2015，29(10)：949-951

[8] 劉星綱，鄧旭亮，鄒 超，等.多孔β-磷酸三鈣/ 膠原支架修復兔下頜牙槽骨缺損的實驗研究[J]. 北京口腔醫(yī)學，2014，22(1)：1-3

[9] 方依婷，曾 艷，張星宇，等.兩種羥基磷灰石成骨能力的對比研究[J].解剖學研究，2015，37(4)：268-269