四種蓮子心生物堿對H2O2誘導血管內皮細胞損傷的保護作用

張玉玲,楊光明,李萍,潘揚

(南京中醫藥大學 藥學院，江蘇 南京 210046)

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四種蓮子心生物堿對H2O2誘導血管內皮細胞損傷的保護作用

張玉玲,楊光明,李萍,潘揚Δ

(南京中醫藥大學 藥學院，江蘇 南京 210046)

目的 探討中藥蓮子心中4種生物堿蓮心季銨堿(Lot)、蓮心堿(Lien)、異蓮心堿(Iso)和甲基蓮心堿(Nef)對H2O2誘導人臍靜脈內皮細胞株ECV304氧化損傷的保護作用。方法 采用MTT法測定不同濃度Lot、Lien、Iso和Nef 對正常和H2O2損傷ECV304細胞活性的影響，通過比色法測定并比較各組細胞一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)的水平。結果 Lot、Lien、Iso和Nef對正常ECV304細胞形態和活性均無影響；Lot為100 μmol/L， Lien、Iso和Nef為0.1 μmol/L時，對H2O2致損內皮細胞活性有較好的緩解作用，此時細胞活性分別為H2O2損傷組的112.8%、129.3%、125.6和118.2%(P<0.01或0.05)。4種生物堿在上述劑量時對H2O2致損內皮細胞形態的改善作用與陽性藥卡托普利基本相近，除Lot的作用較弱外，Lien、Iso和Nef均可使受損內皮細胞的細胞間隙縮小，細胞彼此相連增強，細胞邊界變清晰。另外，且4種蓮子心生物堿均可提高H2O2致傷內皮細胞的NO濃度(P<0.05)，增加損傷內皮細胞的NOS活性(P<0.05)。結論 蓮心季銨堿、蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿均對H2O2誘導內皮細胞損傷的有一定的保護作用，其作用機制可能是通過增加NOS生成提高血管內皮細胞釋放NO，從而發揮保護內皮的功能。

蓮心季銨堿；蓮心堿；異蓮心堿；甲基蓮心堿；血管內皮細胞；H2O2誘導損傷

當前我國心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)的發病率在不斷攀升，發病年齡也有所提前，這種不斷上升趨勢主要與人們生活水平提高、生活習慣改變、人口老齡化、環境不斷變化等導致CVD的危險因素持續增長有關，已成為我國當今社會人群健康所面臨的重要公共衛生問題，加強心血管疾病的防治已刻不容緩。血管內皮細胞位于血流與平滑肌細胞之間，其損傷和功能的改變在多種CVD發病過程中起著至關重要的作用，尤其是對動脈粥樣硬化發病的始動環節。內皮功能障礙主要表現為一氧化氮(NO)等內皮依賴性舒張因子(endothelium derived relaxing factor，EDRF)分泌減少或生物利用度降低，而內皮素(endothelin,ET)等內皮依賴性收縮因子(endothelium derived contracting factor，EDCF)分泌增多[1]。氧化應激引起的內皮細胞氧化損傷是引起血管內皮功能障礙的重要原因，它使氧自由基大量產生，引起細胞膜脂質過氧化、蛋白質和核酸變性，導致內皮不可逆損傷；同時活性氧還參與以內皮細胞脫落為特征的“失巢凋亡”[2]。目前，H2O2誘導內皮細胞分泌NO失衡導致內皮細胞凋亡越來越受到人們的關注，因此對NO水平進行調控有望成為治療氧自由基引起的內皮細胞凋亡異常相關心血管疾病的有效策略。而利用祖國傳統中醫藥改善細胞功能、保護內皮細胞免受損傷是防治CVD的重要手段之一[3]。

蓮子心為常用中藥，來源于睡蓮科植物睡蓮成熟種子NelumbonuciferaGaertn.的綠色幼葉及胚根，具有清心安神、去熱，交通心腎、澀精止血之功效[4]。蓮子心中異喹啉類生物堿是其主要活性成分，其中以蓮心季銨堿(Lot)、蓮心堿(Lien)、異蓮心堿(Iso)和甲基蓮心堿(Nef)為代表[5-6]。在前期研究中，本課題組已獲得了純度較高的這4種生物堿，并對它們的光(波)譜數據進行了詳細的解析[7-8]。近年來，很多研究已發現Nef對損傷的內皮細胞具有保護作用[9-11]，但至今尚未見對這4種生物堿保護受損內皮細胞作用比較的研究報道。本文擬采用形態學觀察和MTT法測定Lot、Lien、Iso和Nef 對正常和H2O2損傷人臍靜脈內皮細胞株ECV304活性的影響，并通過比色法測定各組細胞一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)的水平，以評估蓮子心4種生物堿對損傷內皮細胞的保護功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要實驗儀器：酶標儀(BIORAD，USA)；倒置相差顯微鏡(OLYMPUS bx-50)；CO2培養箱(Forma3111，USA)；Countess全自動細胞計數儀(Invitrogen，USA)；酶聯免疫檢測儀(BIORAD，USA)；L-650Y超聲波細胞破碎機(上海皓莊儀器有限公司)。

1.1.2 藥品與試劑：蓮心季銨堿、蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿，均從蓮科植物Nelumbo nucifera Gaertn. 種子的幼葉及胚根分離純化得到，并經UV、IR、NMR和MS鑒定結構[5-6]，HPLC面積歸一化法分析，4種生物堿純度均大于95%。4種生物堿均用DMSO溶解配成高濃度的母液備用。

RPMI-1640培養液(美國GIBCO，P1520)；小牛血清(杭州四季清生物工程材料有限公司)；噻唑藍(MTT，上海伯奧生物科技公司)；二甲基亞砜(DMSO，上海凌鋒化學試劑有限公司)；次黃嘌呤[Hypoxanthine，SIGMA(Cell Culture Tested)，086K06621]；黃嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，IGMA，024K37841)；NO及NOS試劑盒(南京建成生物工程研究所)；卡托普利(Captopril，Fluka)。

1.1.3 細胞株：人臍靜脈內皮細胞細胞株ECV304(中科院上海生化細胞研究所，由本校王明艷教授傳代并惠贈)，按照文獻方法進行體外培養[12]。

1.2 細胞懸液的制備 常規方法復蘇凍存的ECV304細胞，用RPMI-1640完全培養液培養，待細胞鋪滿培養瓶底時，棄去培養液，加入0.25%胰蛋白酶液消化成細胞懸液，PBS緩沖液洗2～3遍，換新鮮細胞培養液，混勻，即得細胞懸液。

1.3 H2O2體外誘導內皮細胞的損傷 取上述細胞懸液，使終濃度約為1×105個/mL，接種于24孔培養板中，每孔180 μL，每孔加入不同濃度H2O2和生理鹽水各10 μL，使H2O2終濃度分別為0，0.1，0.2，0.4，1，2和4 mmol/L，于CO2培養箱中培養24 h后，倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態及生長狀況，每孔加入50 μL 10 mg /mL MTT溶液，孵育4 h，傾去上清，每孔加100 μL DMSO，振蕩10 min，使藍紫色結晶充分溶解，酶標儀上于490 nm處測定OD值，按下式計算各組增值抑制率。

1.4 4種生物堿對正常內皮細胞活性的作用 取細胞懸液，按上法操作，實驗分組：①空白對照組：正常細胞培養，不加藥物；②陽性對照組：加卡托普利(Cap)使終濃度為10 μmol/L；③給藥組：Lot組、Lien組、Iso組、Nef組，每個藥物分別設4個終濃度：100、10、1、0.1 μmol/L。培養24 h后，顯微鏡下觀察細胞的形態及生長狀況，MTT法測定各孔的OD值。

1.5 不同濃度的4種生物堿對H2O2損傷內皮細胞活性的影響 取細胞懸液，按上法操作，實驗分組：①空白對照組：正常細胞培養，不加藥物及H2O2；②模型(H2O2)組：僅加H2O2；③陽性對照組：Cap(終濃度為10 μmol/L)+H2O2；④給藥組：Lot組(Lot+H2O2)、Lien組(Lien+H2O2)、Iso組(Iso+H2O2)、Nef組(Nef+H2O2)，每個藥物分別設4個終濃度：100、10、1、0.1 μmol/L。H2O2造模終濃度根據“1.1.3”項下結果來確定。培養24 h后，顯微鏡下觀察細胞的形態及生長狀況，MTT法測定各組OD值。

1.7 NOS活性的測定 本法的原理在于NOS催化L-Arg和分子氧反應生成NO，NO與親核性物質生成有色化合物，在530 nm波長下測定其吸光度，根據吸光度的大小可計算出NOS活性。按照“1.4”項下方法進行操作，按NOS試劑盒說明書操作，530 nm波長、0.5 cm光徑，比色，并按下式計算各組細胞NOS活性。

(消光系數ε：L/nmol；體積：mL；光徑：cm；反應時間：min)

1.8 統計學方法 采用SPSS統計軟件的One-Way ANOVA過程進行單因素方差分析及均值多重比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 H2O2致損內皮細胞濃度的確定 在倒置相差顯微鏡下觀察：空白對照組與0.1 mmol/L H2O2損傷組血管內皮細胞在形態上基本無差別，細胞生長狀態良好，貼壁較牢，細胞間連接緊密，細胞呈多角形或短梭形，邊界清楚，大小均勻。0.2、0.4 mmol/L H2O2損傷組血管內皮細胞呈現收縮、變圓，胞體變小，細胞間隙增寬，部分細胞脫落現象。1、2、4 mmol/L H2O2損傷組血管內皮細胞則出現胞膜邊緣不清晰，部分胞膜不完整，甚至損傷破裂，有較多細胞脫落，并形成大片脫失區。見圖1。

圖1 不同濃度H2O2致損內皮細胞的形態學觀察(×200)A.空白對照；B. 0.1 mmol/L H2O2；C. 0.2 mmol/L H2O2；D. 0.4 mmol/L H2O2Fig.1 Different concentrations of H2O2-induced damage morphology of endothelial cells (×200)A.control group; B. 0.1 mmol/L H2O2 group; C. 0.2 mmol/L H2O2 group;D.0.4 mmol/L H2O2 group (×200)

MTT法測定結果表明：與空白對照組相比，除0.1 mmol/L H2O2組OD值差異無統計學意義外，其他各濃度損傷組OD值均顯著降低(P<0.05或0.01)。H2O2濃度與對內皮細胞增殖抑制呈現明顯的量效關系，H2O2濃度大，抑制作用越大。0.4 mmol/L即可明顯抑制內皮細胞的增殖(P<0.01)。綜合上述形態學的觀察，本實驗以終濃度為0.4 mmol/L的H2O2作為模型組，其抑制率約為35%左右。見表1。

表1 不同濃度H2O2致損內皮細胞MTT測定(n=4)Tab. 1 Different concentrations of H2O2-induced damage of endothelial cells MTT assay(n=4)

*P<0.05，**P<0.01，與空白對照相比, compared with control group

2.2 4種生物堿對正常內皮細胞活性的影響 MTT法測定表明：與空白對照相比，陽性對照(Cap，10 μmol/L))、給藥組(Lot，Lien，Iso和Nef)各劑量(0.1～100 μmol/L)的OD值均無統計學意義，提示與陽性藥物一樣，Lot、Lien、ISO和Nef對血管內皮細胞無明顯的毒性。見表2。

表2 4種生物堿對正常內皮細胞活性的影響(n=4)Tab.2 Effects of four alkaloids on normal endothelial cell activity(n=4)

2.3 不同濃度的4種生物堿對H2O2致損內皮細胞增殖的影響 MTT法測定表明：4種生物堿對H2O2致損內皮細胞增殖產生促進作用的最低濃度各不相同，Lien+H2O2組和Iso+H2O2組0.1 μmol/L、Nef+H2O2組10 μmol/L及Lot+H2O2組100 μmol/L的OD值均顯著高于模型組(P<0.05或0.01)。除Lot外，Lien、Iso和Nef均隨著劑量的增加，對細胞增殖的抑制作用也不斷增大。同時發現：3者濃度高于100 μmol/L時，藥物顯示的是抑制受損細胞增殖的作用，因此本實驗采用Lot為100 μmol/L，Lien、Iso和Nef均為0.1 μmol/L的藥物劑量為治療劑量進行以下研究，此時細胞活性分別為H2O2損傷組的112.8%、1129.3%、125.6和118.2%(P<0.01或0.05)。見表3。

表3 不同濃度的4種生物堿對H2O2致損內皮細胞增殖的影響(n=4)Tab.3 Four different concentrations of H2O2-induced damage alkaloids on the proliferation of endothelial cells(n=4)

**P<0.01，與空白對照相比，compared with control group；#P<0.05，##P<0.01，與模型組相比，compared with model group

2.4 4種生物堿對H2O2致損內皮細胞形態的影響 在倒置相差顯微鏡下觀察：與空白對照相比，陽性藥物Cap+H2O2組血管內皮細胞與之形態相似，生長狀態良好，貼壁較牢，連接緊密，邊界清楚，呈多角形或短梭形，部分變圓，大小均勻。4種生物堿在治療劑量時對H2O2致損內皮細胞形態的改善作用與陽性藥物基本相近，除Lot的作用稍差外，Lien、Iso和Nef均可使受損內皮細胞的細胞間隙縮小，細胞彼此相連增強，細胞邊界變清晰。見圖2。

圖2 4種生物堿對H2O2致損內皮細胞形態的影響(×200)A. 模型組；B. Cap+H2O2；C. Lot+H2O2；D. Lien+H2O2；E. Iso+H2O2；F. Nef+H2O2Fig.2 Four alkaloids on H2O2-induced loss of endothelial cell morphology(×200)B. Model group; B. Cap+H2O2 group；C. Lot+H2O2 group；D. Lien+H2O2 group；E. Iso+H2O2 group；F. Nef+H2O2 group

2.5 4種生物堿對H2O2致損內皮細胞NO水平的影響 結果表明：與空白對照組(52.82 μmol/L)相比，模型組NO濃度(29.35 μmol/L)顯著降低(P<0.05)，說明H2O2誘損內皮細胞模型已具備。與模型組相比，4種生物堿除Lot的NO濃度無統計學意義外，Lien(51.45 μmol/L)、Iso(44.83 μmol/L)和Neo(53.99 μmol/L)與陽性對照Cap(52.44 μmol/L)一樣，NO濃度均顯著提高(P<0.05)。Lien、Iso和Neo與陽性對照組相比，NO濃度的提升并無統計學差異。3種蓮子心生物堿之間NO濃度也無統計學差異，但以Nef的最高。見圖3。

圖3 4種生物堿對H2O2致損內皮細胞NO濃度的影響(n=4)*P<0.05，與空白對照相比；#P<0.05，與模型組相比Fig.3 Effects of four alkaloids on H2O2-induced loss of endothelial NO concentration cells(n=4)*P<0.05，compared with blank group; #P<0.05，compared with model group

2.6 4種生物堿對H2O2致損內皮細胞NOS水平的影響 結果表明：與空白對照組(8.25 μmol/L)相比，模型組NOS活性(5.57 μmol/L)顯著降低(P<0.05)，說明H2O2誘損內皮細胞模型已具備。與模型組相比，4種生物堿Lot(7.84 μmol/L)、Lien(8.12 μmol/L)、Iso(8.16 μmol/L)和Neo(8.24 μmol/L)與陽性對照Cap(8.10 μmol/L)一樣，NOS活性均顯著提高(P<0.05)。4種蓮子心生物堿與陽性對照組相比，NOS活性的提升差異并無統計學意義。4種蓮子心生物堿之間NOS活性差異也無統計學意義，但以Lot的最低。見圖4。

圖4 4種生物堿對H2O2致損內皮細胞NOS活性的影響(n=4)*P<0.05，與空白對照相比；#P<0.05，與模型組相比Fig.4 Four alkaloids on H2O2-induced endothelial cell damage NOS activity(n=4)*P<0.05，compared with blank group; #P<0.05，compared with model group

3 討論

由于人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)的原代培養有難度，因此失去體內原代細胞的一些特點內皮細胞株應運而生。ECV304細胞是較為經典的人臍靜脈內皮自發轉化形成的細胞系，盡管先前有學者對其能否替代HUVEC提出疑問[13]，但它仍被作為血管內皮細胞的模型在國內廣泛應用[14]。最近有學者還建立了nanoLC-ESI/MS/MS對ECV304細胞的蛋白質組學研究的方法并對其進行了初步的分析，為內皮損傷機制的蛋白質組學研究奠定了實驗基礎[15]。

H2O2是體內氧化代謝的中間產物，是一種活性氧，同時H2O2很易穿透細胞膜到達胞內位點，因此積累到一定程度會造成細胞損傷，但H2O2產生過多或暴露時間過長也會造成內皮細胞不可逆損傷。綜合MTT測定和形態學的觀察，本實驗以終濃度為0.4 mmol/L的H2O2作為模型組，從形態學上看雖然內皮細胞收縮、變圓，胞體變小，細胞間隙增寬，但細胞邊界尚清楚，形狀亦有一定規則，細胞彼此仍然相連，部分細胞有脫落現象，說明僅有少量細胞出現壞死、死亡，其各項指標與正常狀態已有區別，同時其抑制率約為35%，此時施加保護因子來抑制細胞損傷最佳。

形態學觀察和MTT法測定結果表明，Lot、Lien、ISO和Nef對正常ECV304的細胞形態和活性均無影響；Lot為100 μmol/L，以及Lien、Iso和Nef均為0.1 μmol/L時，對H2O2致損內皮細胞活性有較好的緩解作用，此時細胞活性分別為H2O2損傷組的112.8%、129.3%、125.6和118.2%(P<0.01或0.05)。4種生物堿在上述劑量時對H2O2致損內皮細胞形態的改善作用與陽性藥卡托普利基本相近，除Lot的作用稍差外，Lien、Iso和Nef均可使受損內皮細胞的細胞間隙縮小，細胞彼此相連增強，細胞邊界變清晰。比色法測定結果還表明，Lien、ISO和Nef均可提高H2O2致損內皮細胞的NO濃度(P<0.05)；且這4種蓮子心生物堿均可增加損傷內皮細胞的NOS活性(P<0.05)。

綜上所述，蓮心季銨堿、蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿(特別是后3者)對H2O2誘導的內皮細胞損傷有一定的保護作用，其作用機制可能是通過增加NOS生成提高血管內皮細胞釋放NO，從而發揮保護內皮的功能。

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(編校：吳茜)

Protective effects of four alkaloids of embryo loti on H2O2-induced oxidative damage of vascular endothelial cells

ZHANG Yu-ling,YANG Guang-ming,LI Ping, PAN YangΔ

(School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China)

ObjectiveTo observe protective effects of four active liposoluble alkaloids of a Chinese herb, lotusine (Lot), liensinine (Lien), isoliensinine (Iso) and neferine (Nef) of embryo loti (the green embryo), against H2O2-induced oxidative damage on human umbilical vascular endothelial cell ECV-304.MethodsThe protective effects of Lot, Lien, Iso and Nef on the survival of normal and oxidatively damaged ECV 304 cells were studied by cell morphology observation and 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium (MTT) assay. The levels of nitric oxide (NO) and nitric oxide synthase (NOS) were measured using colorimetric assay.ResultsLot, Lien, Iso and Nef did not affect cell morphology and cell viability of normal ECV 304 cells. The survival of oxidative damaged vascular endothelial cells was rescued by incubating with Lot at 100 μmol/L, and Lien, Iso and Nef at 0.1 μmol/L. The proliferative activity of medicated groups increased to 112.8%, 129.3%, 125.6 and 118.2%, respectively (P<0.01 or 0.05), relative to that of the group with H2O2induced oxidative damage. The four alkaloids restrained oxidative injury of endothelial cells induced by H2O2and the protective influences were similar with captopril, which served as a positive control. Each alkaloid except Lot reduced intercellular space and increased the connections of oxidative damaged cells, concomitant with more recognizable cell borders. Lien, Iso and Nef also increased the concentration of NO (P<0.05). Besides, all of the four alkaloids activated NOS in damaged vascular endothelial cells (P<0.05).ConclusionThe four alkaloids of embryo loti, especially Lien, Iso and Nef, have certain protective effects against H2O2-induced oxidative damage on vascular endothelial cells. The protective mechanism may be promotion of NO release through the increase of NOS production.

lotusine; liensinine; isoliensinine; neferine; vascular endothelial cells; H2O2-induced oxidative damage

國家自然科學基金(81373295)；江蘇省高校優勢學科建設工程資助項目(ysxk-2014)

張玉玲，女，碩士在讀，研究方向：中藥化學與生物技術研究，E-mail：95794608@qq.com；潘揚，通訊作者，男，博士、研究員、博士生導師，研究方向：生物制藥及中藥作用機理，E-mail：y.pan2006@163.com。

R932

A

1005-1678(2015)03-0001-05