丹皮酚對HepG2細胞藥物轉運體BCRP及SLCO1B1表達及功能的影響

王莉莉，于超

(重慶醫科大學 生命科學研究院，重慶 400016)

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丹皮酚對HepG2細胞藥物轉運體BCRP及SLCO1B1表達及功能的影響

王莉莉，于超Δ

(重慶醫科大學 生命科學研究院，重慶 400016)

目的 分析丹皮酚對肝細胞株HepG2細胞藥物轉運體乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer-resistance protein，BCRP)及有機陰離子轉運多肽1B1(organic anion-transporting polypeptide 1Bl，SLCO1B1)表達及部分轉運功能的影響。方法 采用CCK8法檢測丹皮酚對HepG2細胞存活率的影響，以確定適當的用藥濃度；qPCR法測定丹皮酚對HepG2細胞BCRP及SLCO1B1 mRNA表達水平的影響；流式細胞術測定丹皮酚對BCRP及SLCO1B1轉運特異性底物脫鎂葉綠酸鹽和二氯熒光素功能的影響。結果 丹皮酚在2～8 μg/mL濃度范圍內對HepG2細胞存活率影響較小，丹皮酚濃度高于16 μg/mL時，HepG2細胞存活率明顯降低(P<0.05)。與對照組相比，丹皮酚組BCRP及SLCO1B1藥物轉運體的mRNA水平均明顯上調，對特異性底物的轉運效率明顯增加(P<0.05)。結論 丹皮酚能夠誘導肝細胞藥物轉運體BCRP及SLCO1B1基因表達，從而促進其底物的跨膜轉運。提示當丹皮酚與BCRP及SLCO1B1轉運體所轉運的藥物聯合應用時，可能存在藥物相互作用風險。

丹皮酚；HepG2細胞；乳腺癌耐藥蛋白；有機陰離子轉運多肽1B1

藥物代謝酶及藥物轉運體在體內藥物代謝中起著非常重要的作用，長期以來研究者主要關注藥物代謝酶介導的藥物相互作用，對藥物轉運體介導的藥物相互作用近年來才受到越來越多的重視[1-4]。研究表明：許多藥物(如抗動脈粥樣硬化HMG-CoA抑制劑——他汀類藥物)在體內主要依賴藥物轉運體的跨膜轉運發揮治療作用[5-6]。其中，有機陰離子轉運多肽1B1(organic anion-transporting polypeptide 1Bl，SLCO1B1)是攝入型轉運體，特異性表達于肝臟，攝取轉運大量分子結構各異的化合物，促進藥物聚集于胞內[2]。相反，乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer-resistance protein，BCRP)是一個外排型轉運體，廣泛分布于小腸、直腸、肝臟、腎臟、干細胞、卵巢、乳腺、腦、心臟以及腫瘤細胞中[7]。所以，BCRP轉運體主要負責減少轉運藥物進入內臟、血腦屏障、胎盤屏障或將內源性底物排入膽汁、尿液，從而發揮降低靶組織藥物濃度或體內血藥濃度等生理功能[8]。因此，SLCO1B1與BCRP對人體內藥物分布與排泄起到了非常重要的作用。

丹皮酚(paeonol)為毛茛科植物牡丹PaeoniasuffrutlcosaAndr根皮及蘿藦科植物徐長卿Cynanchumpaniculatum(Bge.)Kitag的干燥根和根莖中的主要活性成分之一，其藥理作用廣泛，具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等作用[9-11]。近年來研究發現，丹皮酚可抑制藥物轉運體P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-GP/MDR1)表達，從而降低P-糖蛋白對藥物的外排功能[12-13]。那么丹皮酚是否可以通過影響肝細胞SLCO1B1及BCRP轉運體的藥物轉運功能，進而影響與其聯用藥物的體內分布與排泄，最終影響相關藥物的療效，促進藥物-藥物相互作用，目前尚未見報道。因此，本實驗主要分析丹皮酚是否影響SLCO1B1與BCRP的基因表達，通過檢測2者對特異性底物的轉運能力，推測丹皮酚對2種轉運體跨膜轉運藥物功能的影響，預測潛在的藥物-藥物間相互作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 丹皮酚(純度：99%)購自南京澤朗植提。二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma。脫鎂葉綠酸鹽(PhA)與二氯熒光素(DCF)購自百靈威科技。TaKaRa RNAiso Plus及PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)購自寶生物工程(大連)有限公司；引物用Primer Premier 5.0軟件設計，委托華大基因合成；DMEM培養基及胎牛血清購自Gibco公司；CCK8試劑盒購自碧云天。細胞培養板購自Costar公司。

1.2 細胞培養 細胞株人肝癌細胞HepG2為本實驗室保存。HepG2細胞接種于含10%滅活胎牛血清、抗生素(100 mg/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)的DMEM高糖培養基中。HepG2細胞在37 ℃、5%CO2的飽和濕度培養箱內培養。用0.25%胰酶消化、傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 主要溶液配制

1.3.1 丹皮酚溶液的配制：分別稱取2、4、8、16 mg丹皮酚溶于1 mL DMSO中，超聲震蕩，以0.22 μm過濾膜濾過，終質量濃度濃度分別為2、4、8、16 μg/ μL， 4 ℃冰箱保存。

1.3.2 脫鎂葉綠酸鹽(PhA)溶液的配制：稱取0.593 mg PhA，溶于1 mL DMSO溶液中，超聲震蕩，以0.22 μm過濾膜濾過，終質量濃度為0.593 μg/ μL，4 ℃冰箱保存。

1.3.3 二氯熒光素(DCF)溶液的配制：稱取4.012 mg DCF，溶于1 mL DMSO溶液中，超聲震蕩，以0.22 μm過濾膜濾過，終質量濃度為4.012 μg/ μL，4 ℃冰箱保存。

1.4 實驗分組與處理 Control組：含0.1%DMSO培養基組；丹皮酚處理組：分別加入各濃度丹皮酚溶液1 μL，使丹皮酚終濃度分別為2、4、8 μg/mL，同時，DMSO終濃度為0.1%。實驗處理：細胞接種約36 h后，丹皮酚組加入不同濃度的丹皮酚，control組加同體積終濃度為0.1%的DMSO處理24 h。

1.5 CCK8法 取對數生長期細胞，調整細胞密度為5×104個/mL，接種于96孔板中，每孔200 μL。18 h后，按分組培養處理，每個組分別設置5個復孔，同時設置空白對照組。藥物分別作用6,12,24,48 h后，每孔加入100 μL比例為1:10的CCK8與DMEM的混合液，繼續培養2.5 h后，在酶聯免疫檢測分析儀上測定A450值。按以下公式計算藥物對細胞存活率的影響，實驗以3次平行實驗數據為最終結果：細胞存活率 = (A處理-A空白)/(A對照-A空白)×100%。

1.6 Real-time qPCR法檢測BCRP及SLCO1B1轉運體mRNA的表達 采用Trizol法提取總RNA；用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒按說明書操作反轉錄成cDNA。熒光定量PCR檢測BCRP(82bp)及SLCO1B1(165bp)轉運體基因產物，以GAPDH(226bp)做內參。反應體系：SYBR green mix 10 μL、上下游引物各0.6 μL、cDNA 2 μL、RNase-free水6.8 μL；反應條件：95°C 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40次循環，于65 ℃～95 ℃條件下檢測溶解曲線。

BCRP序列上游引物： 5′-AGCAGGGACGAACAATCATC-3′，下游引物： 5′-GGGCCAATAAGGTGAGGCTATCA-3′；SLCO1B1序列上游引物：5′-TGAATGCCCAAGAGATGA-TG-3′，下游引物： 5′-ATTGAGTGGAAACCCAGTGC-3′; GAPDH引物序列上游: 5′-GTGAAGGTCGGAGTCA-ACGG3′，下游引物： 5′- CCTGGAAGA-TGGTGATGGGAT-3′。

1.7 流式細胞術檢測BCRP及SLCO1B1轉運體功能 取對數生長期細胞，調整細胞密度為4×105個/mL，接種于6孔板中，每孔接種細胞懸液1 mL。36 h后，向control組、丹皮酚2、4、8 μg/mL組中分別加入1 μL DMSO、1 μL 2、4、8 μg/μL丹皮酚溶液，處理24 h后加入轉運體特異性熒光底物1 μL DCF[14](4.012 μg/ μL)或1 μL PhA[15](0.593 μg/ μL)，于37 ℃、5%CO2的飽和濕度培養箱內培養30 min，按照細胞培養傳代方式處理，預冷PBS懸浮后進行流式細胞儀分析。同時設置空白組。

2 結果

2.1 不同濃度丹皮酚對HepG2細胞存活率的影響 采用CCK8法對丹皮酚的細胞增殖效應進行分析，結果顯示：與control組相比，2、4、8 μg/mL丹皮酚并不降低細胞增殖效應，但16 μg/mL丹皮酚顯著降低細胞增殖效應，其存活率分別為97.85%、94.99%、91.23%、84.70%，見圖1。提示丹皮酚(2～8 μg/mL)對 HepG2細胞增殖效應無影響，故后續實驗采用該濃度范圍。

圖1 丹皮酚對HepG2細胞存活率的影響(n=5)*P<0.05，與對照組相比Fig.1 Effect of various concentrations of paeonol on viability of HepG2 cell(n=5)*P<0.05, compared with control group

2.2 丹皮酚不同處理時間對HepG2細胞存活率的影響 采用CCK8法對丹皮酚的細胞增殖效應進行分析，結果表明：8 μg/mL 丹皮酚處理HepG2細胞6、12、24、48 h，存活率分別為98.51%、96.31%、91.46%、89.36%。雖然隨著丹皮酚作用時間的延長，HepG2細胞存活率相應降低，但細胞存活率大部分超過90%(見圖2)。提示2～8 μg/mL丹皮酚處理HepG2細胞24 h對其活力影響不大。故以下實驗對細胞進行藥物處理時間均采用24 h。

圖2 丹皮酚不同處理時間對HepG2細胞存活率的影響(n=5)*P<0.05，與對照組相比Fig.2 Effect of various treatment time of paeonol on viability of HepG2 cells(n=5)*P<0.05, compared with control group

2.3 丹皮酚對HepG2細胞中BCRP、SLCO1B1 mRNA表達的影響 將培養的HepG2細胞以不同濃度的丹皮酚(2～8 μg/mL)分別作用24 h。結果顯示：丹皮酚可顯著上調細胞中BCRP與SLCO1B1 mRNA的表達(P<0.05)。2 μg/mL丹皮酚可分別上調BCRP與SLCO1B1 mRNA表達2倍與3.5倍，4、8 μg/mL丹皮酚雖對BCRP與 SLCO1B1 mRNA仍有誘導作用，但誘導作用較2 μg/mL丹皮酚降低，見圖3。提示丹皮酚可能通過誘導HepG2細胞的藥物轉運體BCRP、SLCO1B1mRNA表達影響其對底物的轉運效率。

圖3 丹皮酚孵育HepG2細胞后BCRP及SLCO1B1轉運體mRNA的變化(n=5)*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與對照組相比Fig.3 Expression levels of transporters BCRP and SLCO1B1 mRNA after incubation of paeonol(n=5)*P<0.05,**P<0.01， ***P<0.001, compared with control group

2.4 丹皮酚對HepG2細胞BCRP、SLCO1B1轉運功能的影響 用流式細胞技術檢測不同濃度丹皮酚作用細胞24 h后，對特異性熒光底物的轉運效率。結果顯示：與對照組比較，不同濃度丹皮酚(2～8 μg/mL)處理組的熒光強度值均顯著降低(P<0.05)。其中2 μg/mL濃度處理組熒光強度值降低幅度最大，達2倍，見圖4。提示丹皮酚可增強HepG2細胞BCRP對藥物的外排功能。

圖4 丹皮酚對HepG2細胞BCRP轉運特異性底物PhA的影響(n=5)*P<0.05，***P<0.001，與對照組相比Fig.4 Effect on BCRP-mediated PhA transfer after the incubation of paeonol(n=5)*P<0.05, ***P<0.001, compared with control group

同樣亦觀察到2～8 μg/mL丹皮酚較對照組能明顯增高熒光強度值(P<0.05)，其中2 μg/mL時熒光強度值增高幅度最大，達5～6倍，見圖5。結果表明丹皮酚能增強HepG2細胞SLCO1B1對藥物的轉運能力。

圖5 丹皮酚對HepG2細胞SLCO1B1轉運特異性底物DCF的影響(n=5)*P<0.05, ***P<0.001，與對照組相比Fig.5 Effect on SLCO1B1-mediated DCF transfer after the incubation of paeonol(n=5)*P<0.05,***P<0.001, compared with control group

3 討論

隨著藥物代謝動力學的發展，藥物轉運體逐漸成為近年來研究的熱點，其對闡明藥物間相互作用和指導臨床用藥有重要意義。其中，BCRP外排多種內、外源性物質，比如：他汀類(匹伐他汀、瑞舒伐他汀)、拓撲替康、伊馬替尼、舒尼替尼、米托蒽醌等[16-17]。而SLCO1B1攝取多種內、外源性物質，如：他汀類藥物(匹伐他汀、瑞舒伐他汀、西立伐他汀、辛伐他汀等)、芐青霉素、甲氨蝶呤、頡沙坦、伊立替康等。因此，BCRP與SLCO1B1對其底物在體內的代謝過程有重要影響[2, 18]。本課題即從轉運體的角度，研究丹皮酚對轉運體的影響。

本研究發現，丹皮酚可顯著誘導BCRP與SLCO1B1的 mRNA表達與轉運效率，提示其轉運功能的增強很可能是其基因表達上調所致。此外，本研究亦發現丹皮酚在低濃度時誘導作用BCRP最強，且丹皮酚對SLCO1B1的誘導作用較更強，前者是后者的2.5倍。因此，當丹皮酚與BCRP或SLCO1B1轉運體的共同底物作用時，藥物的攝取率均是顯著增強的。

研究發現，丹皮酚能夠下調P-gP的藥物外排泵功能，使化療藥物在細胞內濃度增加[12-13]；黃酮類等結構特異性藥物對BCRP與SLCO1B1轉運體分別有一定的抑制作用，進而發生藥物相互作用[17, 19-25]。本研究通過實驗證實丹皮酚能夠同時誘導BCRP與SLCO1B1轉運體，且對SLCO1B1的誘導作用顯著強于BCRP，為丹皮酚和SLCO1B1與BCRP的轉運藥物聯合用藥時可能發生藥物-藥物相互作用提供了體外實驗數據。

但丹皮酚在體內是否對BCRP與SLCO1B1仍具有誘導作用目前尚不清楚，且丹皮酚誘導BCRP與SLCO1B1表達的信號機制亦不清楚。故未來本課題的研究將主要考察丹皮酚對藥物轉運體的體內效應及其調控機制。

[1] Glei M,Kirmse A,Habermann N,et al.Bread enriched with green coffee extract has chemoprotective and antigenotoxic activities in human cells[J].Nutr Cancer,2006,56(2): 182-192.

[2] Kim RB.Transporters and drug disposition[J].Curr Opin Drug Discov Devel,2000,3(1): 94-101.

[3] Konig SK,Herzog M,Theile D,et al.Impact of drug transporters on cellular resistance towards saquinavir and darunavir[J].J Antimicrob Chemother,2010,65(11): 2319-2328.

[4] Weiss J,Haefeli WE.Interaction potential of the endothelin-A receptor antagonist atrasentan with drug transporters and drug-metabolising enzymes assessed in vitro[J].Cancer Chemother Pharmacol,2011,68(4): 1093-1098.

[5] Neuvonen PJ.Drug interactions with HMG-CoA reductase inhibitors (statins): the importance of CYP enzymes,transporters and pharmacogenetics[J].Curr Opin Investig Drugs,2010,11(3): 323-332.[6] Corsini A,Bellosta S.Drug-drug interaction with statins[J].Expert Rev Clin Pharmacol,2008,1(1): 105-113.

[7] Cusatis G,Sparreboom A.Pharmacogenomic importance of ABCG2[J].Pharmacogenomics,2008,9(8): 1005-1009.

[8] Mizuno T,Terada T,Kamba T,et al.ABCG2 421C>A polymorphism and high exposure of sunitinib in a patient with renal cell carcinoma[J].Ann Oncol,2010,21(6): 1382-1383.

[9] Li H, Dai M, Jia W.Paeonol attenuates high-fat-diet-induced atherosclerosis in rabbits by anti-inflammatory activity[J].Planta Med,2009,75(1): 7-11.

[10] 戴敏，訾曉梅，彭代銀，等，丹皮酚抗鵪鶉實驗性動脈粥樣硬化作用[J].中國中藥雜志，1999，24(8)：40-42，64.

[11] 楊正生，彭振輝，姚青海，等.丹皮酚的藥理作用研究進展[J].中國藥物與臨床，2011，11(5)：545.

[12] 董會月.丹皮酚逆轉人白血病耐藥細胞系K562/ADM細胞多藥耐藥的作用研究[D].2010，福建：福建中醫藥大學.

[13] 孫慧君，王曉琦，于麗敏，等.丹皮酚對MDR逆轉作用的研究[J].解剖科學進展，2000，6(1)：59-62.

[14] 和泉沙希，小森高文，野崎芳胤.用于篩選能夠增強或抑制OATP1B1轉運活性的化合物的方法、及用于確定OATP1B1表達水平的方法[P].CN 103597090 A.

[15] Lepist EI,Gillies H,Smith W,et al.Evaluation of the endothelin receptor antagonists ambrisentan,bosentan,macitentan,and sitaxsentan as hepatobiliary transporter inhibitors and substrates in sandwich-cultured human hepatocytes[J].PLoS ONE,2014,9(1): e87548.

[16] Keskitalo JE,Zolk O,Fromm MF,et al.ABCG2 polymorphism markedly affects the pharmacokinetics of atorvastatin and rosuvastatin[J].Clin Pharmacol Ther,2009,86(2): 197-203.

[17] Kondo C,Suzuki H,Itoda M,et al.Functional analysis of SNPs variants of BCRP/ABCG2[J].Pharm Res,2004,21(10): 1895-1903.

[18] Hsiang B,Zhu Y,Wang Z,et al.A novel human hepatic organic anion transporting polypeptide (OATP2).Identification of a liver-specific human organic anion transporting polypeptide and identification of rat and human hydroxymethylglutaryl-CoA reductase inhibitor transporters[M].J Biol Chem,1999,274(52): 37161-13168.

[19] Cooray HC,Janvilisri T,van Veen HW,et al.Interaction of the breast cancer resistance protein with plant polyphenols[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,317(1): 269-275.

[20] Fan L,Zhang W,Guo D,et al.The effect of herbal medicine baicalin on pharmacokinetics of rosuvastatin,substrate of organic anion-transporting polypeptide 1B1[J].Clin Pharmacol Ther,2008,83(3): 471-476.

[21] Hirano M,Maeda K,Shitara Y,et al.Drug-drug interaction between pitavastatin and various drugs via OATP1B1[J].Drug Metab Dispos,2006,34(7): 1229-1236.

[22] Michaelis M,Rothweiler F,Nerreter T,et al.Karanjin interferes with ABCB1,ABCC1,and ABCG2[J].J Pharm Pharm Sci,2014,17(1): 92-105.

[23] Wang X,Wolkoff AW,Morris ME.Flavonoids as a novel class of human organic anion-transporting polypeptide OATP1B1 (OATP-C) modulators[J].Drug Metab Dispos,2005,33(11): 1666-1672.

[24] Weiss J,Rose J,Storch CH,et al.Modulation of human BCRP (ABCG2) activity by anti-HIV drugs[J].J Antimicrob Chemother,2007,59(2): 238-245.

[25] 應帥，鄭婷婷，陳培遠，等.BCRP/ABCG2的結構功能及相關抑制劑研究[J].中國醫藥生物技術，2013，8(3)：201-205.

(編校：吳茜)

Effect of paeonol on expression and function of drug transporters BCRP and SLCO1B1 in HepG2 cell

WANG Li-li, YU ChaoΔ

(Institute of Life Sciences, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)

ObjectiveTo investigate influences of paeonol on mRNA expression and function of drug transporters BCRP and SLCO1B1 in HepG2 cell.MethodsCell counting Kit-8 assay was used to detect the viability of HepG2 cells;Real-time fluorescent quantitative PCR (qPCR) was performed to measure the expressions of BCRP and SLCO1B1 mRNAs; flow cytometry was applied to determine the transport functions of BCRP and SLCO1B1.ResultsPaeonol (2-8 μg/mL) did not decrease HepG2 cell survival rate, but 16 μg/mL paeonol significantly reduced cell survival rate(P<0.05).Paeonol(2-8 μg/mL)significantly induced the mRNA expression and function of drug transporters BCRP and SLCO1B1(P<0.05).Compared with control group, transcription level of paeonol group’s BCRP and SLCO1B1 drug transporters obviously up-regulated, the of translocation efficiency of substrate specificity increased significantly (P<0.05).ConclusionPaeonol can induce drug hepatocellular transporters BCRP and SLCO1B1 gene expression, thereby promote the substrate transport the transmembrane.It is indicated that the drug combination of paeonol and BCRP and SLCO1B1 transporters, there may be a risk of drug interactions.

paeonol;HepG2 cell;breast cancer-resistance protein;organic anion-transporting polypeptide 1B1

國家自然科學基金(81370403)

王莉莉，女，碩士在讀，研究方向：藥物代謝動力學，E-mail:wanglili1020@sina.cn；于超，通訊作者，男，博士，教授，研究方向：藥物代謝動力學，E-mail:yuchaom@163.com。

R966

A

1005-1678(2015)03-0006-04