川芎嗪對急性腦梗死模型大鼠硫化氫、血漿膽紅素和氧化低密度脂蛋白水平變化及意義

張國珍,鄭維紅,梁戎

(1.內蒙古自治區人民醫院 干部保健所，內蒙古 呼和浩特 010017；2. 廈門大學附屬中山醫院 神經內科，福建 廈門 361004)

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川芎嗪對急性腦梗死模型大鼠硫化氫、血漿膽紅素和氧化低密度脂蛋白水平變化及意義

張國珍1,鄭維紅2Δ,梁戎1

(1.內蒙古自治區人民醫院 干部保健所，內蒙古 呼和浩特 010017；2. 廈門大學附屬中山醫院 神經內科，福建 廈門 361004)

目的 探究川芎嗪對急性腦梗死模型大鼠硫化氫、血漿膽紅素和氧化低密度脂蛋白水平變化及意義。方法 健康的SD大鼠100只，體質量(250±30)g，雌雄不限，隨機分為5組(對照組、假手術組、模型組、西藥組和川芎嗪組)，每組20只，實驗各組用線栓法制備局灶性腦缺血模型。正常組、模型組與假手術組，1次/天靜脈注射無菌生理鹽水10 mL，川芎嗪組靜脈注射川芎嗪注射液10 mL /(kg·d)，西藥組靜脈注射阿托伐他汀注射液10 mL /(kg·d)，在實驗第10天時處死一半大鼠檢測相關指標，第20天時，處死余下各組大鼠。取血檢測硫化氫、血漿膽紅素和氧化低密度脂蛋白水平，取腦觀察其病理學改變。結果 與對照組及假手術組相比，川芎嗪組和西藥組H2S及血漿膽紅素水平均有明顯上升，差異具有統計學意義(P<0.05)；治療20d后，與西藥組相比，川芎嗪組H2S及血漿膽紅素水平上升更為顯著(P<0.05)。與對照組及假手術組相比，川芎嗪組和西藥組Ox-LDL水平均有明顯下降，差異具有統計學意義(P<0.05)；治療20 d后，與西藥組相比，川芎嗪組Ox-LDL水平下降更為顯著(P<0.05)。各組大鼠腦組織病理學切片顯示：川芎嗪組：少數神經細胞死亡,細胞質疏松及腫脹明顯減輕；西藥組:細胞核少見固縮，腦組織水腫有減輕；模型組大鼠:腦組織周圍神經元腫脹并出現皺縮，細胞核固縮，梗死灶內細胞和血管壞死，正常組織消失，結構模糊、間質水腫；對照組及假手術組大鼠:細胞形態正常，分布均勾，未見皮質部蒼白梗死。結論 川芎嗪能夠升高急性腦梗死模型大鼠硫化氫、血漿膽紅素水平，升高氧化低密度脂蛋白水平，對臨床具有指導意義。

川芎嗪；急性腦梗死；硫化氫；血漿膽紅素；氧化低密度脂蛋白

腦梗死是由于供應腦組織的動脈發生病變所導致的疾病，常伴偏癱、失語、偏盲、意識障礙甚至死亡[1]，約占全部腦血管病的 75%[2]。急性腦梗死指腦缺血發生在6～12 h之內，缺血區腦組織蒼白、輕度腫脹，神經細胞、膠質細胞及內皮細胞呈明顯缺血改變[3]。缺血性腦血管病的主要病理基礎為動脈粥樣硬化(arteriosclerosis，AS)。目前 AS 的發病機制尚不完全清楚，近年來的研究顯示血脂水平和動脈粥樣硬化病變的程度之間的關系十分密切，而血漿水平的脂質水平升高能夠促使動脈粥樣硬化形成[4]。川芎是一種常用中藥，隨著人們對其研究的深入，川芎嗪在預防和治療多種疾病方面的藥理作用及臨床應用非常廣泛，研究發現其提取物川芎嗪有抗血小板聚集、擴張小動脈、改善微循環和腦血流的作用[5]。在治療閉塞性血管疾病、脈管炎、炎癥、冠心病等。抗癌，保護肝腎，保護神經等方面都有較好的療效，但在治療急性腦梗死方面的研究較少，為了探索治療急性腦梗死的新思路，改善其預后，筆者通過研究川芎嗪對急性腦梗死模型大鼠硫化氫、血漿膽紅素和氧化低密度脂蛋白水平變化及意義來探究川芎嗪對于治療急性腦梗死的療效，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康的SD大鼠100只，體質量(250±30)g，7～8周齡，雌雄不限，自由攝食及飲水，飼養室環境溫度23 ℃ ，相對濕度70%。本實驗遵循《動物實驗保護條例》。

1.2 試劑及儀器 川芎嗪注射液(北京市燕京藥業有限公司，國藥準字H20043160)；阿托伐他汀注射液(輝瑞制藥有限公司，國藥準字J20120050)。日立7170S生化分析儀；美國ADL公司生產ELISA試劑盒；高速低溫離心機(TGL20M)；全自動酶標儀(Bio-Tek Elx800)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型的建立：采用改良的Zea Longa法[6]制作MACO手術，線栓法制備局灶性腦缺血模型，隨機選取60只大鼠，術前12 h停飼，將大鼠用10%腹腔內注射3 mL/kg水合氯醛麻醉，待其無翻正反射后，頭仰位四肢固定于手術臺上，消毒后頸部正中剪開長約20～25 mm皮膚，顯微鏡下游離頸內動脈(ICA)，右側頸總動脈(CCA)和頸外動脈(ECA)，近心端依次結扎CCA、ECA,結扎翼腭動脈(PPA)，用微動脈夾分別夾住CCA近心端和ICA，然后在距CCA分叉近心端5 mm處剪一小口，去除動脈夾，將栓線向ICA方向順利插入約18～20 mm，有明顯阻力感時停止插入，松開PPA微動脈夾，剪去線栓尾端部分，系牢ICA以固定尼龍線，逐層縫合皮下組織及皮膚并用青霉素局部消毒。術后將大鼠保持側臥位，保持呼吸道通暢，監測體溫在37 ℃左右并注意保暖。

1.3.2 假手術組大鼠模型的建立：假手術組大鼠將栓線由ECA斷端插入ICA，保留約1 min后將栓線拔出,將結扎ECA斷端，逐層縫合皮下組織及皮膚并用青霉素局部消毒,其余步驟同手術各組大鼠。

1.3.3 分組及處理：將手術大鼠隨機分為川芎嗪組、西藥組和模型組，每組20只，未經干預小鼠作為正常組。即共分為5組，對照組、假手術組、模型組、西藥組和川芎嗪組，每組各20只。造模當天開始，正常組、模型組與假手術組1次/天靜脈注射無菌生理鹽水10 mL，川芎嗪組靜脈注射川芎嗪注射液10 mL /(kg·d)，西藥組靜脈注射阿托伐他汀注射液10 mL /(kg·d)，在實驗第10天時處死一半大鼠檢測相關指標，第20天時，處死余下各組大鼠檢測相關指標。

1.4 檢測指標及觀察方法 分別于干預10 d和20 d時取各組大鼠血漿3 mL，2 mL加入抗氧化劑(Ox-LDL測定)和抗凝劑，余下用于檢測硫化氫和血漿膽紅素。

1.4.1 硫化氫含量的檢測：分別于干預10 d和20 d時取各組大鼠0.1 mL血漿標本混勻，加入0.5 mL 1%醋酸鋅，0.5 mL 20 mmol/L對苯二胺鹽酸鹽以及0.5 mL 30 mmol/L三氯化鐵，離心取上清液，采用亞甲藍分光光度法(在波長652 nm下進行檢測)。檢測上清液的吸光度(A)值。根據標準曲線計算上清液中H2S含量。

1.4.2 血漿膽紅素含量的檢測：分別于干預10 d和20 d時取各組大鼠血漿用釩酸鹽氧化法測定血漿總膽紅素。第一試劑14 μm與標本10 μL，讀取1次吸光度，加第二試劑35 μL，第2次讀取吸光度，前后2次吸光度之差與標準吸光度之差比較，即膽紅素量。

1.4.3 氧化低密度脂蛋白含量的檢測：分別于干預10 d和20 d時取各組大鼠血漿2 mL應用酶聯免疫吸附(ELISA)雙抗體夾心法，測定待測樣品中的Ox-LDL含量。

1.4.4 腦組織病理學檢測：分別于干預10 d和20 d時用20%烏拉坦腹腔注射麻醉，采用頸椎脫臼法處死后各組大鼠，立即斷頭取腦，固定48 h后，進行常規的石蠟包埋，切片，染色。

2 結果

2.1 模型驗證

2.1.1 Bederson評分法 參照Bederson評分法[7]，0分：無神經功能缺失癥在大鼠麻醉蘇醒后6 h內評定。1分：提起鼠尾離地面約33 cm時對側前肢屈曲；2分：觀察前肢的肌張力，前肢屈曲及對側軀體抵抗力下降；3分：將大鼠置于平滑地板上，推動阻力下降，行走時向對側轉圈；4分：眼分泌物增多，向對側轉圈及意識障礙。1分以上者即為造模成功。見表1。

表1 各組神經功能缺失評分表±s，分)Tab.

2.1.2 MR掃描方法：MR掃描方法采用MR成像系統對造模6 h后所有大鼠模型行MR掃描，模型組大腦出現高信號，表示造模成功。見圖1。

圖1 急性腦梗死大鼠MR掃描圖Fig.1 MR of acute cerebral infarction rats

2.2 硫化氫(H2S)水平比較 與對照組及假手術組相比，川芎嗪組和西藥組H2S水平均有明顯上升，差異具有統計學意義(P<0.05)；治療20 d后，與西藥組相比，川芎嗪組H2S水平上升更為顯著(P<0.05)。見表2。

表2 治療前后各組H2S水平Tab.

*P<0.05，compare with control group，△P<0.05，compare with western medicine group

2.3 血漿膽紅素水平比較 與對照組及假手術組相比，川芎嗪組和西藥組血漿膽紅素水平均有明顯上升，差異具有統計學意義(P<0.05)；治療20 d后，與西藥組相比，川芎嗪組血漿膽紅素水平上升更為顯著(P<0.05)。見表3。

表3 治療前后各組血漿膽紅素水平Tab.3 Plasma bilirubin level of all group before and after ±s，μmol/L)

*P<0.05，compare with control group，△P<0.05，compare with western medicine group

2.4 氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)水平比較 與對照組及假手術組相比，川芎嗪組和西藥組Ox-LDL水平均有明顯下降，差異具有統計學意義(P<0.05)；治療20天后，與西藥組相比，川芎嗪組Ox-LDL水平下降更為顯著(P<0.05)。見表4。

表4 治療前后各組ox-LDL水平比較Tab.4 Comparison of ox-LDL of all group before and after ±s，μmol/L)

*P<0.05，compare with control group；△P<0.05，compare with western medicine group

2.5 腦組織病理學改變 各組大鼠腦組織病理學切片顯示：川芎嗪組：少數神經細胞死亡，細胞質疏松及腫脹明顯減輕；西藥組：細胞核少見固縮，腦組織水腫有減輕；模型組大鼠：腦組織周圍神經元腫脹并出現皺縮，細胞核固縮，梗死灶內細胞和血管壞死，正常組織消失，結構模糊、間質水腫；對照組及假手術組大鼠：細胞形態正常，分布均勾，未見皮質部蒼白梗死，見圖2。

圖2 各組大鼠腦組織病理學切片Fig.2 Brain tissue pathological slices of rat

3 討論

有研究表明，急性腦梗死發生動脈粥樣硬化的關系密切，而血漿水平的脂質水平升高能夠促使動脈粥樣硬化形成[8]。硫化氫(hydrogensulfide，H2S)是一種具有臭雞蛋氣味的毒性氣體，以前的研究多集中于其毒性作用[9]。20世紀90年代，人們發現機體還可以內源性產生含量相當高的H2S，內源性，具有舒張血管平滑肌、降低血壓、抑制血管平滑肌細胞增殖及抗氧化應激等多種效應[10]。通過調節KAPT通道直接舒張血管平滑肌使腦血管舒張，改善腦血流量。抑制平滑肌的增殖和促進細胞的凋亡，抑制血管的重塑。這些均表明H2S在缺血性腦血管疾病的發病過程中可能起著重要的保護作用[11]。膽紅素主要來源于血紅蛋白的分解代謝，在體內具有抗氧化性，減少氧化低密度脂蛋白的生成。研究資料顯示，急性腦梗死患者血中膽紅素顯著降低，這可能由于急性腦梗死患者血中膽紅素下降，使體內自由基清除能力下降，導致體內脂類過氧化反應促進動脈粥樣硬化[12]。有有研究表明其與低密度脂蛋白(LDL)有密切關系[13]。LDL促進動脈粥樣硬化的發生發展主要通過Ox-LDL的作用得以實現。低密度脂蛋白被氧化后形成了氧化低密度脂蛋白而氧化低密度脂蛋白又有新的生物活性，加速脂質沉積，從而促使動脈粥樣硬化形成以及促使血栓形成，并且Ox-LDL能夠引起血管內皮細胞功能障礙和內皮細胞損傷，這一作用是啟動動脈粥樣硬化發生的重要環節[14]。Ox-LDL誘導內皮細胞凋亡是動脈粥樣硬化發生的始動環節[15]。形成從而引起急性腦梗死發生。川芎是一種常用中藥，隨著人們對其研究的深入，川芎嗪在預防和治療多種疾病方面的藥理作用及臨床應用非常廣泛，但對于川芎嗪對急性腦梗死的研究尚少為了探索這個問題，改善其預后，進行了本研究。

研究結果顯示，與對照組及假手術組相比，川芎嗪組和西藥組H2S及血漿膽紅素水平均有明顯上升，差異具有統計學意義(P<0.05)；治療20 d后，與西藥組相比，川芎嗪組H2S及血漿膽紅素水平上升更為顯著(P<0.05)。證明川芎嗪能夠升高H2S及血漿膽紅素水平，抑制動脈硬化的形成。與對照組及假手術組相比，川芎嗪組和西藥組Ox-LDL水平均有明顯下降，差異具有統計學意義(P<0.05)；治療20 d后，與西藥組相比，川芎嗪組Ox-LDL水平下降更為顯著(P<0.05)。證明川芎嗪能夠降低脂蛋白水平，治療急性腦梗死。各組大鼠腦組織病理學切片顯示：川芎嗪組：少數神經細胞死亡，細胞質疏松及腫脹明顯減輕；西藥組:細胞核少見固縮，腦組織水腫有減輕；模型組大鼠：腦組織周圍神經元腫脹并出現皺縮，細胞核固縮，梗死灶內細胞和血管壞死，正常組織消失，結構模糊、間質水腫；對照組及假手術組大鼠：細胞形態正常，分布均勻，未見皮質部蒼白梗死。

綜上所述，川芎嗪能夠升高急性腦梗死模型大鼠硫化氫、血漿膽紅素水平，升高氧化低密度脂蛋白水平，對臨床具有指導意義。

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(編校：譚玲)

Significance of Ligustrazine on acute cerebral infarction rat model and its changes on hydrogen sulfide, plasma bilirubin and oxidized low density lipoprotein level

ZHANG Guo-zhen1,ZHENG Wei-hong2Δ,LIANG RONG1

(1. Cadres of Health, Inner Mongolia Autonomous Region People’s Hospital, Hohhot 010017, China; 2. Department of Neural Internal Medicine, Zhongshan Hospital Affiliated to Xiamen University, Xiamen 361004, China)

ObjectiveTo explore significance of Ligustrazine on acute cerebral infarction rat model and its effects on hydrogen sulfide, plasma bilirubin and oxidized low density lipoprotein level.Methods100 healthy SD rats, (250±30) g, male or female, were divided into five groups (control group, sham operation group, model group, western medicine group, and Ligustrazine group)，each had 20. Experimental groups prepared focal cerebral ischemia model with suture method. Normal group, model group and the sham group once daily intravenous injected sterile saline 10 mL, Ligustrazine intravenous injection group injected Ligustrazine 10 mL/(kg·d), the WM group intravenous injected atorvastatin 10 mL/(kg·d). Half of the rats were sacrificed at 10 days of the experiment to detect the relevant indicators, at 20 days, the remaining rats in each group were sacrificed. Blood hydrogen sulfide, plasma bilirubin and oxidized LDL levels were detected, and brain pathology change were observed.ResultsCompared with control group and sham group, in Ligustrazine group and western medicine group,hydrogen sulfide and plasma bilirubin levels increased significantly, and the difference was statistically significant (P<0.05); after 20 days of treatment, compared with western medicine group Ligustrazine group hydrogen sulfide and plasma bilirubin levels rose more significant (P<0.05). Compared with control group and sham group, in Ligustrazine group and western medicine group, OxLDL levels decreased significantly, the difference was statistically significant (P<0.05); after 20 days of treatment, compared with western medicine group, OxLDL levels in Ligustrazine group decreased more significant (P<0.05). The rats brain histopathology examination showed that, Ligustrazine group: few nerve cell death, cytoplasm loose and swelling reduced significantly; WM group: condensation nuclei rare, brain edema relieve; model rats: brain tissue surrounding the nerve yuan swelling and the emergence of shrinkage, nuclear condensation within the infarct cells and vascular necrosis of normal tissue disappeared, fuzzy structure, interstitial edema; the control group and the sham-operated rats: normal cell morphology, distribution, no cortical Ministry pale infarction.ConclusionLigustrazine can increase acute hydrogen sulfide, plasma bilirubin levels in rats with cerebral infarction, elevate level of oxidized low-density lipoprotein, has clinical significance.

Ligustrazine; acute cerebral infarction; hydrogen sulfide; plasma bilirubin; oxidized low-density lipoprotein

張國珍，女，碩士，住院醫師，研究方向：心血管內科疾病診斷與治療，E-mail：zgzing2@163.com；鄭維紅，通訊作者，女，本科，主任醫師，研究方向：癲癇與腦血管病，E-mail：zwh610547@xmu.edu.cn。

R743

A

1005-1678(2015)03-0028-04