當歸補血湯對嗎啡戒斷小鼠紅細胞免疫功能的影響研究

顧鴻,田維毅,梅穎

(1.貴陽中醫學院 實驗針灸教研室，貴州 貴陽 550002；2.貴陽中醫學院 免疫教研室，貴州 貴陽 550002；3.貴陽中醫學院 中藥教研室，貴州 貴陽 550002)

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當歸補血湯對嗎啡戒斷小鼠紅細胞免疫功能的影響研究

顧鴻1,田維毅2,梅穎3

(1.貴陽中醫學院 實驗針灸教研室，貴州 貴陽 550002；2.貴陽中醫學院 免疫教研室，貴州 貴陽 550002；3.貴陽中醫學院 中藥教研室，貴州 貴陽 550002)

目的 研究當歸補血湯對嗎啡戒斷小鼠紅細胞免疫功能的影響。方法 將50只實驗小鼠隨機分為5組：正常組、陽性對照組、藥物高、中、低劑量組。后肢注射嗎啡建立小鼠嗎啡成癮模型。紅細胞計數儀測量5組小鼠的紅細胞膜微粘度(erythrocyte membrane micro-viscosity，EM-MV)、紅細胞變形指數(erythrocyte deformation index，EDI)；采用郭氏法測定紅細胞免疫復合物花環率(red blood cell-immune complex rosette，RBC-ICR)、紅細胞C3b受體花環率(red blood cell-C3b receptor rosette，RBC-C3bRR)；并觀察5組紅細胞免疫黏附促進因子(red blood cell regulator factor enhance rate，RFER)和紅細胞免疫黏附抑制因子(red blood cell immune adherence inhibitor factor，RFIR)變化水平。結果 陽性對照組EM-MV均顯著高于正常組、藥物中劑量組和藥物低劑量組(P<0.05)，陽性對照組EDI顯著低于正常組、藥物中劑量組和藥物低劑量組(P<0.05)。藥物中劑量組和低劑量組較陽性對照組明顯RBC-ICR降低(P<0.05)，RBC-C3bRR顯著高于陽性對照組(P<0.05)；藥物中劑量組和低劑量組RFER水平顯著高于陽性對照組，RFIR顯著降低RFER(P<0.05)。結論 低劑量組和高劑量組當歸補血湯提高嗎啡戒斷小鼠的紅細胞免疫功能，改善戒斷的癥狀，促進機體的快速康復，具有良好的臨床應用價值。

當歸補血湯；嗎啡戒斷；紅細胞免疫

近年來，阿片藥物的依賴和濫用已成為全球性問題，受到社會的廣泛關注。現代醫學研究發現[1]，當內源性阿片受體被腦啡肽、強啡肽等阿片類藥物占據時，機體就會產生欣快感，這也是引起藥物成癮的生理學基礎。由于阿片類依賴史細胞的一種適應反應，長期服用阿片類藥物會提高中樞抑制的敏感性，正常服用藥物會使敏感性處于潛伏狀態。當斷藥時即表現出反跳性高興奮狀態，如豎尾、激惹等戒斷癥狀。大量研究顯示[1-2]藥物濫用人群的細胞免疫、體液免疫和非特異性免疫功能均受到嚴重損害。基礎研究顯示[3-4]，紅細胞免疫復合物花環率(red blood cell-immune complex rosette，RBC-ICR)會受到阿片類藥物的毒性作用，導致細胞膜上脂質結構發生變化，降低紅細胞膜的流動性，引起細胞膜上C3b受體數量降低，最終使機體的免疫功能下降。因此大量學者開始關注如何提高阿片類藥物戒斷后機體的免疫功能。當歸補血湯源于李東桓的《內傷辨惑論》，全方由當歸、黃芪組成，常用于治療氣血虛弱之證，是經典補血的方劑，它可以促進生血的物質形成，還能顯著改善血液的生理功能，臨床上已經廣泛用于治療免疫功能低下等疾病。本研究觀察當歸補血湯對嗎啡戒斷小鼠紅細胞免疫功能的影響，以期為臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇50只昆明種小鼠，雌雄各半，體質量18～22 g(合格證號：scxk(黔)2002-0001)，由貴陽中醫學院動物中心提供。本實驗遵循《實驗動物保護條例》。

1.2 藥品與試劑 當歸補血湯(自制，濃度為1.0 g/mL)，置于4 ℃冰箱中保存待用。鹽酸嗎啡(沈陽第一制藥廠，國藥準字H20013351)；鹽酸納洛酮(北京四環制藥，H20055758)。

1.3 主要儀器 血細胞計數儀(成都貝斯達儀器有限公司)；高速離心機(江蘇省金壇市環宇科學儀器廠)；生物顯微鏡(上海光學儀器廠，批號H20055758)。

1.4 小鼠嗎啡依賴模型的建立 將各組小鼠籠中喂養4 d后，腹腔皮下注射鹽酸嗎啡，首日劑量10 mg/kg，第2天20 mg/kg，第3天40 mg/kg，第4天60 mg/kg，第5天80 mg/kg。最后1次注射嗎啡后3 h，采用鹽酸納洛酮催癮，若小鼠出現成癮癥狀如豎尾、不停走動、流涎且達到戒斷癥狀的評分標準，則認定造模成功。

1.5 實驗分組 將50例小鼠隨機分為5組：正常組、陽性對照組、藥物高、中和低劑量組，每組10只。正常組：皮下注射與嗎啡等量的生理鹽水，每日1次，連續注射5 d，1周后股動脈取血0.5 mL。藥物高劑量組：最后1次注射嗎啡24 h后，灌胃給予當歸補血湯20 mg/kg；連續給藥7 d，1周后同正常組方法取血。藥物中劑量組灌胃給予當歸補血湯10 mg/kg，其余同藥物高劑量組。藥物低劑量組灌胃給予當歸補血湯5 mg/kg，其余同藥物高、中劑量組。陽性對照組：后肢注射鹽酸嗎啡，首日劑量10 mg/kg，第2天20 mg/kg，第3天40 mg/kg，第4天60 mg/kg，第5天80 mg/kg。最后1次注射嗎啡后3 h，采用鹽酸納洛酮催癮，1周后同正常組方法取血。將各組血樣分裝入離心管(1 mL/支)中，3500 r/min，離心10min后取上清液于-20 ℃凍存備用。

1.6 觀察指標 ①采用熒光偏振法測定EM-MV，檢測方法：取1.0 mg蛋白的紅細胞膜，用1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)為熒光探針測定熒光強度(I)，當DPH進入膜脂層的中烴鏈區后期介質粘度顯著增加，導致順反式異構化轉化受到抑制，當成為全反型時可以發出熒光。微粘度越小，紅細胞膜流動性越大。采用激光衍射法測定TK；②采用郭氏法測定(RBC-CIC)、RBC-C3bRR，具體方法：取試管, 先加待測紅細胞懸液500 μL，然后加補體致敏酵母菌懸液500 μL， 37 ℃水浴30 min，取出后輕輕搖勻,，涂片、固定、染色、計數、換算同RBC-C3b受體花環實驗，其百分率作為紅細胞膜上吸附免疫復合物量的指標。C3b實驗：取1支小試管,先加待測紅細胞懸液50 μL，然后加補體致敏酵母菌懸液50 μL，搖勻37 ℃ 水浴30 min，取出后輕輕搖勻，加生理鹽水100 μL, 再加0. 25%戊二醛50 μL，再搖勻，取50 μL水平涂片。吹干后用姬姆薩-瑞氏染液染色1 min,，再加少許的瑞氏緩沖液染10 min，用自來水沖洗。最后在高倍顯微鏡下計數200個紅細胞中的酵母菌的花環數，并換算成百分率，作為RBC-C3b受體活性的指標；③觀察四組RFER(RFER)和RFIR(RFIR)變化水平。

2 結果

2.1 5組小鼠EM-MV和變形性對比 陽性對照組EM-MV均顯著高于正常組、藥物中劑量組和藥物低劑量組(P<0.05)，說明藥物依賴可以降低紅細胞膜的流動性，低劑量組和高劑量組當歸補血湯可有有效提高紅細胞膜流動性。陽性對照組TK顯著低于正常組、藥物中劑量組和低劑量組(P<0.05)，說明藥物依賴可以降低紅細胞的變形性，低、中劑量當歸補血湯可有效改善藥物依賴引起的紅細胞變形性降低；而高劑量當歸補血湯對紅細胞膜的流動性和變形性改善程度不明顯，見表1、圖1-5。

表1 5組小鼠EM-MV和TK比較Tab.1 Comparison of level of EM-MV andTK of five ±s)

△P<0.05，與陽性對照組相比，compared with positive control group

圖1 各組紅細胞變形情況1.正常組；2.陽性對照組；3.藥物低劑量組；4.藥物中劑量組；5藥物高劑量組Fig.1 Changes in erythrocyte deformability of each group

2.2 5組RBC-ICR和RBC-C3bRR比較 陽性對照組小鼠RBC-ICR顯著升高，與正常組相比有統計學意義(P<0.05)；藥物中劑量組和低劑量組較陽性對照組顯著降低(P<0.05)。陽性對照組RBC-C3bRR較正常組顯著降低(P<0.05)，藥物中劑量組和藥物低劑量組與陽性對照組相比差異具有統計學意義(P<0.05)；而藥物1組免疫復合物花環率和RBC-C3bRR與陽性對照組相比差異無統計學意義，見表2。

表2 5組小鼠RBC-ICR和RBC-C3bRR比較Tab.2 Comparison of level of RFER and RFIR of five ±s)

△P<0.05，與陽性對照組相比，compared with positive control group

2.3 5組小鼠RFER和RFIR變化水平比較 陽性對照組小鼠RFER明顯降低，RFIR顯著升高，與正常組相比，具有統計學意義(P<0.05)。陽性對照組相比，藥物中劑量組和低劑量組RFER水平顯著升高，RFIR顯著降低(P<0.05)；藥物高劑量組RFER和RFIR水平與陽性對照組差異無統計學意義，見表3。

表3 5組小鼠RFER和RFIR變化水平比較Tab.3 Comparison of level of RFER and RFIR of five ±s)

*P<0.05，與陽性對照組相比，compared with positive control group

3 討論

目前已經證實[5]，紅細胞是機體血液循環中的重要免疫細胞。紅細胞不僅可以作為氧和二氧化碳的載體，還能特異性的識別、殺滅或清除血液循環中的免疫復合物。目前研究證實[6]，紅細胞免疫在嗎啡戒斷后的免疫低下中起著重要的作用，其中最重要的是β內啡肽。β內啡肽對紅細胞免疫功能起到雙向調節作用，少量β內啡肽可以提高紅細胞的免疫功能；當β內啡肽水平大量增加時，就會抑制紅細胞免疫功能，且這種作用可以被納洛酮阻斷[7-8]。這說明β內啡肽是通過與細胞膜表面的阿片受體結合而起到免疫調節作用。

紅細胞具有運載 O2和 CO2，維持能量代謝和內環境穩定的功能，又具有識別、黏附、殺傷抗原、清除血循環中的免疫復合物，免疫黏附細菌、病毒、腫瘤細胞及效應細胞，參與機體免疫調控，并有完整的自我調控系統。中醫認為，氣血是構成生命的基本物質。當氣血不足時會引起機體免疫功能低下，通過補益氣血可以有效提高機體對疾病的抵抗能力。本研究對嗎啡戒斷的小鼠給予當歸補血湯，結果發現陽性對照組EM-MV均顯著高于正常組、藥物中劑量組和藥物低劑量組(P<0.05)，說明藥物依賴可以降低紅細胞膜的流動性，低、中劑量當歸補血湯可有效提高紅細胞膜流動性。陽性對照組TK顯著低于正常組、藥物高劑量組和藥物中劑量組(P<0.05)，說明藥物依賴可以降低紅細胞的變形性，低、中劑量當歸補血湯可有效改善藥物依賴引起的紅細胞變形性降低；而高劑量當歸補血湯對紅細胞膜的流動性和變形性改善程度不明顯。這證實合適劑量的當歸補血湯可以有效改善紅細胞的功能，對紅細胞免疫功能有一定的促進作用，而隨著劑量增大，這種促進作用增加的趨勢并不明顯。藥物中劑量組和低劑量組較陽性對照組免疫復合物花環率顯著降低(P<0.05)，C3b受體花環率顯著高于陽性對照組(P<0.05)；藥物中劑量組和低劑量組RFER水平顯著高于陽性對照組，RFIR顯著降低(P<0.05)，這證實了5 mg/kg和10 mg/kg當歸補血湯可有效增強紅細胞對免疫復合物的清除能力，改善紅細胞的免疫功能。而當劑量繼續增大至20 mg/kg時，上述指標改善程度并無提高趨勢。

綜上所述，低、中劑量當歸補血湯提高嗎啡戒斷小鼠的紅細胞免疫功能，改善戒斷的癥狀，促進機體的快速康復，具有良好的臨床應用價值。

[1] 李正紅，于影，楊銳，等.內嗎啡肽對小鼠樹突狀細胞免疫功能的影響[J].中國藥理學通報，2011，27(7)：939-943.

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(編校：王冬梅)

Effect of Danggui Buxue Decoction on red cell immune function in mice with morphine abstinence syndrome

GU Hong1,TIAN Wei-yi2,MEI-Ying3

(1.Teaching and Research Section of Experimental Acupuncture, Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China; 2. Teaching and Research Section of immunology, Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China; 3. Department of Chinese Materia Medica, Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China)

ObjectiveTo study the effect of Danggui Buxue Decoction on red cell immune function in mice with morphine abstinence syndrome.Methods50 mice were randomly divided into normal group,positive control group, high, medium, low dose group,Hindlimb injection of morphine in morphine dependent mice model was established. Erythrocyte membrane were measured in five groups of mice micro viscosity, erythrocyte deformation index; Determination of red cell immune complex rosette rate using the method (CIC), red cell C3b receptor rosette rate; and to observe the five group of regulator factor enhance rate (RFER) and immune adherence inhibitor factor (RFIR) levels.ResultsErythrocyte membrane microviscosity in model group were significantly higher than those in normal group, medium group and low group (P<0.05),red cell deformability index was lower than that of normal group, drug medium group and drug group low (P<0.05).Drug high group and medium group，immune complex rosette rate lower than in model group(P<0.05), C3b receptor rosette rate was significantly higher than that in the model group (P<0.05).ConclusionLow dose group and high dose group Danggui Buxue Decoction raises the red cell immune function in morphine withdrawal mice, improves the withdrawal symptoms, rapids rehabilitation of the body, has good clinical value.

Danggui Buxue Decoction;morphine withdrawal;red cell immun

貴州省科技廳攻關項目([2007]1039)

顧鴻，女，碩士，講師，研究方向：中醫針灸戒毒，E-mail：guhong1212@163.com。

R245.81

A

1005-1678(2015)03-0051-03