漢防己甲素對小鼠血管內皮瘤細胞的影響及其分子機制研究

劉暢,趙寶祥

(1.河南省腫瘤醫院 重癥醫學科，河南 鄭州 450008；2.山東省醫學科學院 腫瘤科，山東 濟南 250100)

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漢防己甲素對小鼠血管內皮瘤細胞的影響及其分子機制研究

劉暢1,趙寶祥2

(1.河南省腫瘤醫院 重癥醫學科，河南 鄭州 450008；2.山東省醫學科學院 腫瘤科，山東 濟南 250100)

目的 探求漢防己甲素對小鼠內皮瘤細胞系EOMA 細胞的影響及其分子機制。方法 采用 MTT方法考察漢防己甲素在時間和濃度上對EOMA細胞的影響；使用流式細胞術檢測漢防己甲素處理后的EOMA細胞內各個不同細胞周期內的含量，推測漢防己甲素對EOMA細胞的G1/S期檢驗點的影響；Western blot方法分析漢防己甲素引起EOMA細胞阻滯的分子機制，并用流式細胞術檢測細胞內活性氧水平，用活性氧清除劑NAC預處理細胞后再進行藥物孵育測定。結果 漢防己甲素能夠有效抑制此細胞的增殖，隨著濃度增加時間延長，細胞增殖率下降；在漢防己甲素20 μM 時作用48 h后便有顯著的抑制作用。漢防己甲素對EOMA細胞周期中G1/S期的細胞阻滯和升高細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平、上調AKT, GSK-3β以及p53等上游蛋白水平，從而使細胞周期阻滯，使周期蛋白的表達發生變化。而ROS的抑制劑NAC可以明顯地抑制EOMA細胞周期因子的調控。結論 漢防己甲素可以抑制腫瘤血管新生，為后續研究將漢防己甲素作為臨床抗癌藥物提供了理論依據。

漢防己甲素；小鼠血管內皮瘤細胞；血管新生；細胞周期阻滯；活性氧

腫瘤組織四周伴有血管與之連接的現象在一百年前就被發現，而腫瘤血管新生的理論卻是由美國的Folkman[1]在上世紀七十年代提出的，這個理論的核心在于研究血管新生于腫瘤生長之間的關系，提出腫瘤生長到一定體積后便刺激周圍的血管新生，已保證腫瘤組織在進一步生長的過程中能夠獲取足夠的營養物質，并且對于腫瘤細胞的轉移有著十分密切的聯系，所以認為抗腫瘤組織周圍的血管新生能夠有效抑制腫瘤的額生長和轉移從而使腫瘤的生長停滯在初期。漢防己甲素(tetrandrine，Tet)其抗腫瘤作用顯著，當前研究顯示抗腫瘤機制包括直接細胞毒作用、誘導凋亡作用、放化療減毒增敏、逆轉耐藥、正常組織的放射保護作用、抗遠處轉移及抗血管新生等[2]。本文通過初步觀察漢防己甲素在體外能夠抑制小鼠內皮瘤細胞系EOMA 細胞的增殖這一現象，探求其作用本質和分子機理，從而為漢防己甲素在抗血管新生上的分子機理和作為抗腫瘤藥物提供理論依據。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株：小鼠內皮瘤細胞株：EOMA，購自美國細胞典藏中心(ATCC)。胎牛血清和DMEM-高糖培養基購自HyClone 公司。青霉素和鏈霉素(AR)均購自sigma 公司。

1.1.2 抗體：CD31購自美國BD 公司；β-tubulin購自Santa Cruz公司；二抗羊抗鼠Ig-HRP、二抗羊抗兔Ig-HRP、CDK-2、Cyclin-E1、AKT 和GAPDH 抗體購自碧云天公司；Cyclin-D2、Cyclin-D3、Cyclin-E2、CDK-4 和CDK-6 購自武漢三鷹公司；Cyclin-D1、p-AKT(Ser473)，P53、P27KIP1、GKS-3β、LC-III-β 和PARP 抗體購自Cell signaling technology 公司。

1.1.3 藥品與試劑：漢防己甲素(TET，粉末狀，DMSO 溶解，配制成20 mM儲存液，于-80 ℃保存)購自上海融禾醫藥科技有限公司；3-(4,5-dimethylthylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra-zolium bromide(MTT)粉末購自美國Amresco公司；熒光ROS探針試劑DCFH-DA購自Invitrogen公司；ROS清除劑N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)購自Sigma公司；PI3K 抑制劑LY-294002購自碧云天公司；羧甲基纖維素鈉(carboxymethyl cellulose sodium，CMC)為本實驗室保存；碘化丙啶(PI，粉末狀)購自美國MP 生物醫藥公司。

1.1.4 實驗動物：10只，SPF級4周齡BALB/c 雄性裸鼠均購于湖北省疾病預防中心，實驗動物均在SPF環境中、12 h晝夜交替飼養。實驗嚴格遵循《實驗動物保護條例》。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT實驗檢測漢防己甲素在時間和濃度上對EOMA 細胞的影響：檢測TET對EOMA細胞的生長抑制作用；在96孔板的每孔中加入1×104個細胞，次日加入不同劑量(0～200 μmol/L)的TET重復3孔。作用24 h后，每孔加入MTT(5 g /L)20 μL，繼續培養3 h，棄上清后，每孔加入100 μL的DMSO，490 nm波長測定各孔的光密度值(opti-cal density，OD), 按公式計算細胞增殖抑制率：抑制率=(對照組A值-實驗組A 值) /(對照組A 值-空白組A值)×100%。

1.2.2 Western blot檢測EOMA 細胞內周期調控蛋白的水平：將30～60 μg樣品放在SDS聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，當溴酚藍(示蹤染料)到達距分離膠底部0.5 cm時，關閉電源，將浸泡好硝酸纖維素膜和吸附濾紙按照支持墊、張吸水紙、凝膠、膜、張吸水紙和支持墊進行組合轉印，4 ℃條件下轉印過夜。轉印完成后，將硝酸纖維素膜封閉液封閉，室溫輕搖1h。一抗反應：加入用封閉液稀釋的一抗10 mL(抗P-gp 、actin特異抗體，1:1000稀釋)，4 ℃輕搖過夜或者室溫2 h。漂洗濾膜3次，每次10 min。二抗反應：將膜用封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標記的相應抗體(稀釋濃度為1:2000)，室溫輕搖1 h。漂洗濾膜3次。ECL法顯色 ：將等體積ECL試劑A液、B液，混合均勻加到轉印膜上，反應5 min。暗室曝光，曝光1～2 min不等，顯影、定影，自來水充分沖洗。蛋白質定量分析： X光片用Mixrotek ScanWizard5掃描軟件進行電腦掃描、Quantity one 7.0圖像分析軟件做灰度分析。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡：收集各組細胞，調整細胞濃度為1×106/mL，按照美國BD公司凋亡試劑盒說明書，分別加入10 μL PI 和5 μL Annexin-V，待反應結束后，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡比。

2 結果

2.1 MTT方法檢測Tet在時間和濃度上對EOMA細胞的影響 不同的處理時間8、12、24、48 h對EOMA 細胞的增殖抑制結果有著較大差別，結果顯示濃度小于10 μM的漢防己甲素對于EOMA細胞的抑制效果不明顯，然而隨著濃度的加大，在大于20 μM 時便會對EOMA細胞有較為明顯的抑制作用，藥物的作用效果表現在作用48 h之后。高濃度組160 μM 甚至在孵育12 h 后便對EOMA細胞有著較為明顯的抑制效果，見圖1。

圖1 Tet對EOMA 細胞增值影響實驗Fig.1 The experimental Tet value effect on EOMA cells

2.2 Tet對EOMA細胞周期的影響 G1期的細胞有不同程度上增加，而S期的細胞隨著濃度的加大而逐漸減少，并且細胞凋亡量很少，和對照組相比差異沒有統計學意義，見圖2。

圖2 Tet對EOMA細胞周期的影響Fig.2 Effect of Tet on cell cycle of EOMA

2.3 Tet影響EOMA 細胞內周期調控蛋白的水平 蛋白在經Tet處理后的EOMA細胞中的表達水平與β-actin相比均出現了不同程度的降低，其中Cyclin-D1，E1以及CDK-2,4的表達量降低地最為明顯，見圖3。

圖3 48 h后Tet處理前后的EOMA細胞中蛋白表達情況Fig.3 The protein expression of EOMA cell before and after Tet treatment at 48 h later

2.4 Tet 對EOMA細胞內ROS水平的影響 EOMA細胞內部的活性氧水平在漢防己甲素的作用下有了很大提升。通過流式細胞術進行了驗證，所示結果顯示無論是30 μM還是50 μM組都能夠引起EOMA細胞內活性氧水平的提升，其中50 μM能夠大幅度提高ROS 在EOMA細胞內的水平，是對照組的2.01倍。證實漢防己甲素的確能引起EOMA細胞內的ROS 含量大幅提升，見圖4。

圖4 Tet對EOMA細胞內ROS水平的影響Fig.4 Effect of Tet on the level of ROS in EOMA cells

2.5 漢防己甲素引起的EOMA細胞周期阻滯依賴于ROS 的上調 NAC能夠有效降低因Tet 引起的EOMA 細胞內ROS 水平的升高，見圖5。

圖5 NAC逆轉Tet引起的EOMA 細胞內ROS 水平的上調Fig.5 The ROS level of NAC reversed Tet induced upregulation of EOMA cells

2.6 AKT抑制劑LY對Tet引起的EOMA細胞內ROS的影響 Tet處理后EOMA細胞內的AKT總量并不發生顯著變化，然而磷酸化水平會明顯降低，并且能夠被ROS清除劑NAC所清除，這表明在Tet引起的EOMA細胞周期阻滯中，ROS能夠調節細胞內的AKT磷酸化水平。

通過 AKT 的抑制劑LY294002(LY)與Tet共同作用下并不改變細胞內的ROS 水平，且其作用效果具有協同效應，見圖6。從而得出AKT 位于ROS 的下游，推測其水平的改變最終作用與細胞內周期相關蛋白的改變，從而引起了細胞周期阻滯。

圖6 AKT抑制劑LY 對Tet 引起的EOMA 細胞內ROS 的影響Fig.6 Effects of AKT inhibitor LY on ROS in Tet induced EOMA cells

3 討論

漢防己甲素是防己科植物粉防己的塊根中提取分離的一種生物堿，在抑制人實體瘤細胞以及白血病細胞及其耐藥細胞株的增殖，誘導腫瘤細胞凋亡方面的研究及其作用機制已經被陸續報道[3]。Wu JM等[4]指出漢防己甲素抑制 BALB/C裸鼠體表結腸癌腫瘤的生長并且誘導其發生凋亡，這種凋亡機制很可能是通過激活MAPK信號通路實現的。而本研究證實，Tet處理后EOMA細胞內的AKT總量并不發生顯著變化，然而磷酸化水平會明顯降低，顯然是啟動激活了MAPK信號通路，而引起細胞凋亡。

研究發現，漢防己甲素能夠有效抑制此細胞的生殖，并呈現出濃度和時間相關性，在漢防己甲素20 μM 時作用48 h后便有明顯的抑制作用[5-6]。漢防己甲素主要是通過引起EOMA細胞周期中G1/S期的細胞阻滯，從而達到抑制細胞增殖的作用[7-10]。這與報道的研究結果類似，漢防己甲素能抑制人胃癌BGC-823細胞具有生長抑制作用，且隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，具有明顯的時間-劑量依賴性[11-12]。而本研究證實漢防己甲素是通過升高細胞內活性氧(ROS)水平的升高達到的細胞周期的阻滯作用，并調節了AKT, GSK-3β以及p53等細胞周期上游蛋白水平，最終使得周期蛋白的表達發生變化。進一步研究證明，漢防己甲素引起細胞內ROS水平的上調從而誘發了EOMA細胞的周期阻滯[13-14]。并且，使用ROS的抑制劑NAC可以明顯地抑制EOMA細胞周期因子的調控[15]。

綜上所述，漢防己甲素是抑制細胞周期的變化新生，從而最終抑制腫瘤生長上的化合物，為后續研究將漢防己甲素作為臨床抗癌藥物提供了理論依據。

[1] Carmeliet P.Angiogenesis in life,disease and medicine[J].Nature,2005,438(23): 932-936.

[2] Risau W and Flamme I.Vasculogenesis[J].Annu Rev Cell Dev Biol,1995,11:73-91.

[3] Risau W.Mechanisms of angiogenesis[J].Nature,1997,386(6626): 671-674.

[4] Wu JM,ChenY,Chen JC,et al.Tetrandrine induces apoptosis and growth suppresion of colon cancer cells in mice[J].Cancer Let,2010,287(2):187-195.

[5] Mikkola HK and Orkin SH.The search for the hemangioblast[J].J Hematother Stem Cell Res,2002,11(1):9-17.

[6] Luttun A,Carmeliet G,Carmeliet P.Vascular progenitors: from biology to treatment[J].Trends Cardiovasc Med,2002,12(15):88-96.

[7] Reyes M,Dudek A,Jahagirdar B,et al.Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow[J].Clin Invest,2002,109(17): 337-346.

[8] Rehman J,Li J,Orschell CM,et al.Peripheral blood "endothelial progenitor cells" are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors[J]Circulation,2003,107(13): 1164-1169.

[9] Takakura N,Watanabe T,Suenobu S,et al.A role for hematopoietic stem cells in promoting angiogenesis[J]Cell,2000,102(15):199-209.

[10] Grant MB,May WS,Caballero S,et al.Adult hematopoietic stem cells provide functional hemangioblast activity during retinal neovascularization[J].Nat Med,2002,8(6):607-612.

[11] Gerber HP,Malik AK,Solar GP,et al.VEGF regulates haematopoietic stem cell survival by an internal autocrine loop mechanism[J].Nature,2002,417(17): 954-958.

[12] Hattori K,Heissig B,Wu Y,et al.Placental growth factor reconstitutes hematopoiesis by recruiting VEGFR1(+) stem cells from bone-marrow microenvironment[J].Nat Med,2002,8(15):841-849.

[13] Lyden D,Hattori K,Dias S,et al.Impaired recruitment of bone-marrow-derived endothelial and hematopoietic precursor cells blocks tumor angiogenesis and growth[J].Nat Med,2001,7(11): 1194-1201.

[14] Luttun A,Tjwa M,Moons L,et al.Revascularization of ischemic tissues by PlGF treatment,and inhibition of tumor angiogenesis,arthritis and atherosclerosis by anti-Flt1[J].Nat Med,2002,8(2):831-840.

[15] Folkman J and D'Amore PA.Blood vessel formation: what is its molecular basis?[J].Cell,1996,87(22):1153-1155.

(編校：王冬梅)

Effect of tetrandrine on murine hemangioendothelioma cell and its molecular mechanisms

LIU Chang1,ZHAO Bao-xiang2

(1.Department of Intensive Medicine, Henan Tumor Hospital, Zhengzhou 450008, China; 2.Department of Oncology, Shandong Province Academy of Medical Sciences, Jinan 250100, China)

ObjectiveTo explore tetrandrine on murine hemangioendothelioma cell and its mechanisms.MethodsExplore the effect of tetrandrine on EOMA cells in time and concentration MTT experiment, the content of tetrandrine treated EOMA cells in different cell cycle detected by flow cytometry, speculated effect of tetrandrine on G1/S phase checkpoint for EOMA cells blocking.Western blot analyzed the molecular mechanism of tetrandrine induced EOMA cell block, and intracellular reactive oxygen species level were detected byflow cytometry.Then used the active oxygen scavenger NAC pretreated cells after drug incubation.ResultsTetrandrine could inhibit the cell reproduction, and showed a concentration and time dependence, role in tetrandrine 20 μM was significantly inhibited after 48 h.Tetrandrine caused mainly by EOMA cells during the cell cycle of G1/S phase cell block, so as to achieve the effect of inhibiting cell proliferation.Tetrandrine increased intracellular reactive oxygen species (ROS) blockade effect of elevated levels of cell cycle to achieve, and the regulation of AKT, GSK-3 β and p53 cell cycle upstream protein level, finally maked the expression changes.Further research proved that, tetrandrine induced up-regulation of ROS level in cells to induce EOMA cell cycle arrest.Moreover, regulated by the ROS inhibitor NAC could significantly inhibit EOMA cell cycle factor.ConclusionTetrandrine can inhibit tumor angiogenesis, which provides theory basis for clinical anti-cancer drugs in inhibiting tumor growth.

tetrandrine;vascular endothelial cells in mice tumor cells;angiogenesis;cell cycle arrest;reactive oxygen species

山東省自然科學基金項目(Z2008B10)

劉暢，男，碩士，醫師，研究方向：腫瘤，E-mail：qch1821460120@163.com。

R735.1

A

1005-1678(2015)03-0054-04