GM-CSF分泌型肝癌疫苗對移植性肝癌小鼠CTL殺傷活性的作用機制

吳天山,肖開提·伊布拉因Δ,阿爾帕提·買買提,李相成

(1.新疆醫科大學第一附屬醫院 急診外科，新疆 烏魯木齊 830054；2.南京醫科大學 臨床醫學系，江蘇 南京 210029)

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GM-CSF分泌型肝癌疫苗對移植性肝癌小鼠CTL殺傷活性的作用機制

吳天山1,肖開提·伊布拉因1Δ,阿爾帕提·買買提1,李相成2

(1.新疆醫科大學第一附屬醫院 急診外科，新疆 烏魯木齊 830054；2.南京醫科大學 臨床醫學系，江蘇 南京 210029)

目的 研究粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)分泌型肝癌疫苗對移植性肝癌小鼠細胞毒性T淋巴細胞殺傷活性的作用機制。方法 本實驗建立3個組別：肝癌疫苗組(A組)，肝癌組(B組)及PBS對照組(C組)。在小鼠體內注入H 22肝癌細胞構建移植性肝癌組，同時建立GM-CSF分泌型肝癌疫苗組及PBS對照組；采用流式細胞術檢測每組小鼠外周血中CD8+T細胞免疫效應分子的表達水平；采用MTT方法檢測各組脾細胞細胞毒T淋巴細胞(CTL)的殺傷活性；采用Western blot方法檢測腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和γ-干擾素(γ-interferon，γ-INF)的表達水平。結果 流式細胞術結果表明，與肝癌組相比，GM-CSF分泌型肝癌疫苗可顯著地增加小鼠外周血中CD8+T細胞的表達(P<0.01)；MTT結果表明，與肝癌組相比，GM-CSF分泌型肝癌疫苗可顯著地增加脾細胞細胞毒T淋巴細胞的殺傷活性(P<0.01)；Western blot結果表明，與肝癌組相比，GM-CSF分泌型肝癌疫苗組可顯著下調TNF-α和γ-INF蛋白的表達(P<0.01)。結論 GM-CSF分泌型肝癌細胞疫苗可顯著地抑制H22肝癌細胞H22的活性，其作用機制可能是通過活化CD8+T細胞的表達和提高脾細胞細胞毒T淋巴細胞的殺傷活性，降低TNF-α和γ-INF蛋白的表達。

粒細胞巨噬細胞集落刺激因子；移植型肝癌；分泌型肝癌疫苗；細胞毒性T淋巴細胞

腫瘤疫苗是腫瘤治療的模式之一，相關的治療方法包括體細胞療法、放射靶向治療法、細胞因子治療法等[1]。以往研究表明[1-2]，腫瘤疫苗的抗腫瘤作用機制可能是通過激活體內特異性細胞免疫和體液免疫反應，發揮其治療腫瘤的作用。佐劑在腫瘤疫苗中發揮著提高免疫原性的作用。在以腫瘤細胞為基礎的主動免疫療法中，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)佐劑的主動免疫療法是當前研究的熱門課題之一[2]。以往臨床試驗研究表明，GM-CSF的疫苗免疫佐劑在前列腺癌、腎癌、惡性黑色素瘤等多種癌癥治療中也發揮一定的抗腫瘤療效[3-5]。因此，本文旨在研究GM-CSF分泌型肝癌疫苗對移植型肝癌小鼠的肝細胞細胞毒性T淋巴細胞殺傷活性作用的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級雌性ICR小鼠60只，5周齡，體質量18～22 g，購自安徽龍科馬生物制藥有限責任公司，許可證號：SYXK(皖)2006-02。本試驗遵循《實驗動物保護條例》。

1.1.2 實驗細胞：GM-CSF 分泌型細胞(每支0.4 mL，含3×106個細胞)購于康乃欣檢驗試劑生物技術有限公司；H22小鼠肝癌細胞株(每支0.1 mL，含有3×106個細胞)購于science cell公司。

1.1.3 主要試劑：MTT、原代腫瘤細胞處理試劑盒(美國Sigma公司)；DMEM培養基(HyClone公司，批號：NYA0598)；胎牛血清(HyClone公司，批號：NM0877)；鼠抗β-actin、鼠抗TNF-α抗體、鼠抗γ-INF抗體(Santa Cruz，批號：#L0610)；辣根酶標記山羊抗鼠IgG(中山金橋，批號：107015)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養：取對數生長期的H 22肝癌細胞，調整成1×105個細胞接種于培養瓶中，采用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養H 22肝癌細胞，將其置于培養箱37 ℃、5%CO2的條件下培養。密切觀察，待細胞貼壁生長后，采用0.25%胰蛋白酶消化傳代，每3～5 d傳代1次。

1.2.2 GM-CSF 分泌型肝癌疫苗的制備：首先將H22肝癌細胞株進行高溫滅活處理，再將其和具有GM-CSF分泌功能的細胞混合(2者的比例為5:3)，當GM-CSF分泌量大于 2 μg/(106個細胞·24 h)時，將其分裝凍存，溶化后每份取1 mL的105/ mL處理后的H22肝癌細胞接種于小鼠淋巴區。

1.2.3 肝癌細胞移植瘤動物模型的建立：將小鼠肝癌細胞株H 22按照3×106個細胞/只注入小鼠腹腔內，在小鼠腹腔內傳代8 d后取出腹水，PBS洗滌3遍，將細胞濃度調整為3×106/mL，取細胞混懸液1 mL接種于小鼠右前肢皮下。待接種7天后，進行皮下免疫治療，接種主動免疫制劑1支(每支0.1 mL)。將上述肝癌細胞移植瘤動物模型隨機分為3組(每組8只)：A組為H 22-GM-CSF組：接種GM-CSF分泌型H 22肝癌疫苗，0.1 mL的H22肝癌細胞與30 μL的GM-CSF分泌細胞的融合液混合后注射小鼠體內；B組為H22肝癌細胞組：接種H22肝癌細胞疫苗，每只小鼠注射H22肝癌細胞0.1 mL；C組為PBS陰性對照組：接種PBS，每只小鼠注射0.1 mL PBS。每周免疫注射1次，總共注射3次。

1.2.4 外周血中CD8+T細胞免疫效應的檢測：分別于每組免疫前和免疫后7 d處死小鼠，采取腹主動脈法取荷瘤鼠外周血液，用流式細胞儀檢測CD8+T細胞免疫效應分子的表達水平。

1.2.5 小鼠脾細胞細胞毒T淋巴細胞細胞殺傷活性的檢測：將免疫前和免疫結束后的小鼠分別處死后，提取其相應的脾細胞，制備成適當的效應細胞混懸液，將上述效應細胞與H 22肝癌細胞(靶細胞)混合后，對靶細胞進行重復刺激，觀察效應細胞對靶細胞的殺傷作用。采用MTT方法進行檢測，將對數生長期的小鼠H 22肝癌細胞配成(1×107個/mL)的混懸液接種于96孔板中，每孔加入100 μL的細胞混懸液，設立靶細胞對照組、效應細胞組和空白對照組。加藥結束后將其置于培養箱孵育5 h。作用結束后，每孔加入MTT溶液后置于37 ℃的培養箱中孵育4 h，用針頭吸出培養上清液，每孔加入100 μL二甲基亞砜震蕩溶解甲瓚，采用酶標儀測定各孔吸光度490 nm(absorbance，A)值，計算脾細胞細胞毒T淋巴細胞的殺傷活性，計算公式：殺傷活性(%)=[1-(效/靶混合細胞的平均A值-效應細胞的平均A值)/對照孔的平均A值]×100%。

1.2.6 Western blot檢測TNF-α和γ-INF蛋白的表達：分別于免疫前和免疫后7 d處死小鼠，采取腹主動脈法收集荷瘤鼠外周血液，收集外周血中CD8+T細胞后，加入含PMSF的蛋白裂解液150 μL，吹打后置于冰上裂解。離心(5 000 r/min)取上清液即為細胞總蛋白。采用DAB試劑盒(Sigma)檢測蛋白含量。采用5% SDS-PAGE 電泳分離蛋白樣品；利用PVDF膜進行轉膜；轉膜完畢后，取出 PVDF 膜，采用PBST清洗3次，每次10 min；加入5%BSA封閉液室溫封閉1 h；加入一抗(1:1000)4 ℃冰箱孵育過夜；再用PBST洗膜3次，每次10 min；加入相應的二抗(1:2000)，室溫孵育1 h；PBST漂洗3次，每次10 min，采用ECL發光試劑盒(Bioword)檢測蛋白表達，曝光，顯影，定影。經Adobe Photoshop 6.0(Adobe Systems，San Jose，CA)分析蛋白表達。

2 結果

2.1 小鼠外周血中CD8+T細胞免疫效應的檢測 采用流式細胞術檢測小鼠外周血中CD8+T細胞免疫效應分子的表達水平(熒光抗體CD8-FITC標記細胞表面抗體)，每組CD8+T細胞亞群所占比例結果表明，免疫后，A組外周血中的CD8+T細胞的含量明顯高于B組、C組(均P<0.01)，見表1。

表1 免疫前后各組小鼠外周血中CD8+T細胞免疫效應的檢測±s)Tab.1 Detection of CD8+T cell immunity of mice in peripheral blood before and after ±s)

**P<0.01，與B組相比，compared with B group；##P<0.01，與C組相比，compared with C group

2.2 MTT法檢測小鼠脾細胞細胞毒T淋巴細胞細胞殺傷活性 每組小鼠分別于免疫前及免疫后7 d處死，收集各組小鼠的脾細胞制備效應細胞的混懸液，以小鼠肝細胞H22(靶細胞)重復刺激后，觀察各組效應細胞的殺傷活性。如圖所示，與B和C組相比，A組效應細胞的殺傷活性顯著性增加(P<0.01)；而B組與C組相比無統計學差異。

圖1 MTT法檢測小鼠的CTL的殺傷活性(n=3)A組：H 22-GM-CSF組；B組：H 22肝癌細胞組；C組：PBS組**P<0.01，與B組相比；##P<0.01，與C組相比Fig.1 The cytotoxicity of CTL examined by MTT assay in each group(n=3)A group：H 22-GM-CSF group； B group：H 22 hematoma cells group； C group：PBS group**P<0.01，compared with B group；##P<0.01，compared with C group

2.3 Western blot檢測TNF-α和γ-INF蛋白的表達 實驗結果顯示，與B組和C組相比，A組的TNF-α和γ-INF蛋白的表達均有顯著性下調，見圖2。

圖2 Western blot法檢測小鼠的CTL中TNF-α，γ-INF的蛋白表達水平(n=3)A組：H 22-GM-CSF組；B組：H 22肝癌細胞組；C組：PBS組**P<0.01，與B組相比；##P<0.01，與C組相比Fig.2 The expression of TNF-α，γ-INF in CTL examined by Western blot assay in each group(n=3)A group：H 22-GM-CSF group； B group：H 22 hematoma cells group；C group：PBS group**P<0.01，compared with B group；##P<0.01，compared with C group

3 討論

腫瘤疫苗是目前腫瘤治療的較為新穎的方法之一。以往研究發現腫瘤疫苗的缺點是由于腫瘤抗原的免疫原性表達較弱，因此機體免疫系統不能識別腫瘤細胞竟而針對性的殺死腫瘤組織[6]。目前，由于免疫輔助劑和藥物緩蝕劑的聯合應用，免疫抗原的表達水平和主動免疫反應明顯提高。GM-CSF作為腫瘤疫苗免疫佐劑，具有刺激造血系統和免疫系統細胞抗原呈遞細胞分化和成熟的功能，此外，GM-CSF還具有增強中性粒細胞和巨噬細胞的抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用，對粒細胞和巨噬細胞具有趨化作用，誘導樹突狀細胞的分化和成熟[7-9]。因此，GM-CSF已在黑色素瘤、腎癌、非小細胞肺癌等多種癌癥的臨床試驗中發揮顯著的療效[10-12]。肝癌的治療方法較多，目前公認的最有效方法是外科切除，但其具有潛在的復發率，因此尋找更為安全的治療方法顯得尤為重要。因此，本文在此探究GM-CSF為免疫佐劑治療肝癌，為肝癌的治療提供更多的理論支持。

以往研究表明，腫瘤的發生過程與機體免疫有著緊密的關系，細胞免疫是抗腫瘤免疫的主要免疫應答之一，其中T細胞介導的細胞免疫應答尤為重要。在T細胞抗原應答反應中，組織相容性復合體(MHC I)類限制性的CD8+T細胞的CTL是抗腫瘤免疫反應的主要效應細胞之一[13]。相關研究表明，CD8+T細胞通過多種細胞因子發揮溶細胞作用，進而殺傷腫瘤細胞的效應。目前的研究表明，IL-6、INF-γ、TNF-α、穿孔素、溶細胞素、脂酶等多種細胞因子和酶在溶解靶細胞中發揮著重要的調控作用[14-15]。因此，本實驗在此選擇檢測CD8+T細胞的表達和相關細胞因子蛋白的表達，探究GM-CSF分泌型肝癌細胞疫苗對移植型肝癌的作用及其可能的作用機制。

本次實驗的結果表明：與H 22肝癌細胞組和PBS對照組相比，GM-CSF分泌型肝癌疫苗免疫小鼠后，可顯著地提高其外周血中CD8+T細胞亞群的表達水平。同時，MTT法檢測GM-CSF分泌型肝癌疫苗對CTL的殺傷作用，結果表明，與H 22肝癌細胞組和PBS對照組相比，GM-CSF分泌型肝癌疫苗可顯著地增強效應細胞的殺傷作用。根據以上結果，由此推測，GM-CSF分泌型肝癌疫苗通過可誘導自體T細胞向CTL增值和分化，發揮特異性抗腫瘤免疫應答功能，而這種功能的發揮與直接活化效應細胞CD8+T細胞有著密切的關系。Western blot檢測了CD8+T細胞表達的INF-γ、TNF-α細胞因子，結果表明，與H 22肝癌細胞組和PBS對照組相比，GM-CSF分泌型肝癌疫苗組可顯著地提高INF-γ、TNF-α蛋白的表達。此結果表明，GM-CSF分泌型肝癌疫苗治療肝癌的作用機制可能與下調INF-γ、TNF-α蛋白的表達有關。

綜上所述，GM-CSF分泌型肝癌疫苗對移植型肝癌具有顯著抑制作用；其抑制作用可能與提高細胞免疫功能有關，作用機制為提高外周血中CD8+T細胞的表達水平、提高效應細胞的殺傷作用以及降低細胞因子INF-γ、TNF-α蛋白的表達有關。

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(編校：王儼儼 吳茜)

Research on mechanism of GM-CSF secreting liver cancer vaccine on CTL killing activity of transplanted liver cancer mice

WU Tian-shan1,XIAOKAITI·Yibulayin1Δ,AERPATI·Maimaiti1,LI Xiang-cheng2

(1.Department of Emergency Surgery, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, China； 2.Department of Clinical Medicine, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)

ObjectiveTo study the effect of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) secreting liver cancer vaccine on killing activity of cytotoxic T lymphocytes (CTL) of transplanted liver cancer mice and its mechanism.MethodsThere were three groups: liver cancer vaccine group (A group), liver cancer group (B group) and PBS group (C group).The transplanted liver cancer model was builded with injection of H 22 hepatoma cells, while the GM-CSF secreting liver cancer vaccine group and PBS group was builded. GM-CSF secreting liver cancer vaccine group and PBS group were establised.The levels of CD8+T cell in peripheral blood were detected by flow cytometry.The killing activity of cytotoxic T lymphocytes (CTL) of spleen cells was detected by MTT method.The expression levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interferon-γ (γ-INF) were detected by Western blot.ResultsThe flow cytometry results showed that, compared with B group, the levels of CD8+T cell of A group significantly increased (P<0.01).MTT results showed that, compared with B group, the killing activity of cytotoxic T lymphocytes (CTL) in A group significantly increased (P<0.01).Western blot results showed that, compared with B group, the expression levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interferon-γ (γ-INF) in A group significantly decreased (P<0.01). ConclusionGM-CSF secreting liver cancer vaccine can significantly inhibit the activity of H22 cell, and its possible mechanism of action may be to activated CD8+T expression, improve cytotoxic activity of CTL of spleen cells, and reduce TNF-α and γ-INF protein expression.

GM-CSF; transplanted liver cancer; secreting liver cancer vaccine; cytotoxic T lymphocytes

國家自然科學基金(81170415)

吳天山，男，學士，主治醫師，研究方向：創傷、急腹癥，E-mail：qch1821460053@163.com；肖開提·伊布拉因，通訊作者，男，碩士，主治醫師，研究方向：創傷、急腹癥，E-mail：qch1821460054@163.com。

R735.7

A

1005-1678(2015)03-0062-03