亞氨基二乙酸芳香衍生物的多核銅配合物氧化切割DNA研究

吳琳琳,李萌,黃婷

(武警四川省總隊醫院 藥劑科，四川 樂山 614000)

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亞氨基二乙酸芳香衍生物的多核銅配合物氧化切割DNA研究

吳琳琳,李萌,黃婷

(武警四川省總隊醫院 藥劑科，四川 樂山 614000)

目的 研究亞氨基二乙酸芳香衍生物的多核銅配合物對DNA氧化切割的影響。方法 合成配合物后，利用電位滴定方法測定配體的質子化常數和配合物的穩定常數，利用瓊脂糖凝膠電泳的方法研究 DNA 的切割作用。結果 在生理條件下配合物H4L1、H4L2、H6L3與Cu2+之間的配位能力較強； 3個多羧酸多銅配合物在等 Cu2+濃度下切割效率均高于相應的單核銅配合物， Cu2+中心之間存在協同作用；配合物H6L3在3者中的 DNA切割效率最高，配合物H4L1次之，配合物H4L2切割效率最低。結論 改變配合物螯合配位基團對于配合物性質有很大的影響，為合理的設計合成銅類核酸酶提供一個理論基礎。

多核銅配合物；DNA氧化切割；人工金屬核酸酶

核酸的斷裂與基因的重組技術是分子生物學與基因工程的核心技術，因而研究人工合成的定點切割核酸的切割劑，即核酸的“分子剪刀”在理論與應用上都具有十分重要的意義。目前在人工核酸切割劑的研究中，金屬配合物占了很大的比重，由于自然界中許多與核酸有關的天然酶的活性部位，含有兩個或多個相互協同作用的金屬離子[1]。近年來，多核金屬配合物作為人工核酸切割劑的研究倍受世人關注，而且具有廣闊的應用前景。金屬配合物具有豐富的結構和生物功能，已被應用于金屬人工核酸酶、金屬抗癌藥物及潛在的基因載體研究等領域。在人工核酸酶研究中，選擇性比切割效率更為重要，而目前金屬核酸酶的設計還未真正達到定位切割的效果。把具有切割性能銅配體與DNA靶向性結合性能的基團連接起來，是實現DNA特異性切割的良好設計策略。亞氨基二乙酸是一種有效的螯合基團，可以與金屬離子形成帶負電的配合物[2]，本研究中以亞氨基二乙酸為基本配位單元，分別用間二甲苯、對二甲苯和均三甲苯這3個橋連基團進行橋連，得到3個配體，3個配體與CuCl2反應得到3個配合物，通過2組配合物的對比，可以闡述金屬中心的螯合基團在DNA氧化切割中的作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 pUC19質粒DNA購自大連寶生物有限公司，小牛胸腺 DNA(CT-DNA)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、溴化 3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓(EB)購自sigma公司。所用溶劑：CuCl2·H2O、亞氨基二乙酸酯均為國產分析純和化學純，使用前未經純化。

1.2 儀器 Titrando809電位滴定儀購自瑞士萬通；PAR273A電化學工作站購自美國EG&G(普林斯頓)；Bruker Advance/AV 500 MHz核磁共振儀購自瑞士布魯克公司。DYCP-31BN凝膠電泳儀購自美國Thermo 公司。

1.3 方法

1.3.1 配體的合成：3個配體根據文獻方法合成[3]。

1.3.2 電位滴定測試：配體的質子化常數和配合物的穩定常數可以通過自動電位滴定進行測定。復合pH玻璃電極采用三點校正。滴定液中配體的濃度均為1.000×10-3mol/L, 配合物滴定過程中，L1、L2、L3與Cu2+的摩爾比分別為1︰2，1︰2和1︰3支持電解質為0.10 mol/L KCl。總體積為15.00 mL。整個滴定過程中通入被水飽和的高純氮氣。每次的滴定體積為15 mL。滴定的pH范圍為2～11.5。 共收集60～120數據點。穩定常數的計算采用南開大學孫宏偉教授的SCMAR程序。配體儲備液配制時加入一定量的氫氧化鈉使其溶解。

1.3.3 DNA切割測試：利用瓊脂糖凝膠電泳的方法研究DNA的切割作用。將超螺旋pUC19質粒DNA與一定量的銅配合物混合，加入1 mmol/L的抗壞血酸(Vc)，再用50 mmol/L Tris-HCl/50 mmol/L NaCl緩沖溶液定容。37 ℃孵化1 h后，加入1 μL終止緩沖劑(EDTA，30 mmol/L；甘油，36%；二甲苯腈藍FF，0.05%；溴酚藍，0.05%)終止反應。利用EB染色的 0.7%凝膠電泳分析切割結果，電泳測定在TAE(40 mmol/L Tris acetate/1 mmol/L EDTA)緩沖液，50 mV電壓下進行2 h，并用UV凝膠成像系統對電泳圖進行拍照成像。根據瓊脂糖凝膠中EB的密度分析來定量每一種形式的DNA。由于EB與超螺旋DNA的嵌入作用低于開環(Form II)及線性(Form III)，因而在定量DNA時，應該在得到的超螺旋DNA含量上乘以一個校正因子1.47。在機理研究中，10%DMSO(羥基自由基清除劑)或10 mmol/L NaN3(單線態氧清除劑)或10 qmmol/L KI(過氧化氫清除劑)首先加入到超螺旋DNA和銅配合物的混合溶液中，在37 ℃溫育 15 min， 然后加入Vc引發反應。

2 結果

2.1 配合物的結構與表征 H4L1：1H NMR(D2O，加入K2CO3)：δ=3.62 ppm(s，8H)，δ=4.30 ppm(s，4H)，δ=7.53 ppm(s，4H)；H4L2：1H NMR(D2O，加入K2CO3)：δ=3.37 ppm(s，8H)，δ=4.00 ppm(s，4H)，δ=7.42 ppm(s，4H)；H6L3：1H NMR(D2O)：δ=4.03 ppm(s，12H)，δ=4.57 ppm(s，6H)，δ=7.77 ppm(s，3H)。

2.2 電位滴定 配合物1，2，3在不同PH值下存在形式和比例見表1。 配合物1，2，3在不同的pH下存在形式不同，見圖1。

表1 配合物1，2，3在不同pH值下存在形式及比例Tab.1 Existing form and proportion of complexes 1, 2, 3 in different pH value

注：“—”代表表中是缺失值

圖1 配合物1、2、3的各存在形式分布曲線Fig.1 Distribution curves of existing forms of the complexes 1,2 and 3

2.3 配合物核酸酶活性

2.3.1 配合物1，2和3對pUC19質粒DNA的切斷：配合物1隨著濃度升高可以逐漸將FormⅠ DNA轉變成Form Ⅱ DNA(FormⅠ：共價閉環形；FormⅡ：開環缺刻形；Form Ⅲ：線形)。當濃度達到18 μmol/L時，開始有Form Ⅲ DNA產生；濃度達到21 μmol/L時，Form Ⅱ DNA和Form Ⅲ DNA同時存在，而Form Ⅰ DNA基本消失。與配合物Ⅰ類似，當配合物2濃度達到21 μmol/L時，Form Ⅰ DNA徹底降解為Form Ⅰ DNA及Form Ⅲ DNA。而配合物3可以在10 μmol/L時將大部分的Form Ⅰ DNA轉變為Form Ⅱ DNA。12 μmol/L時，Form Ⅰ DNA完全轉變為Form Ⅱ DNA及Form Ⅲ DNA。在圖示的4個配合物中，亞氨基二乙酸銅的切割效率最低，即使濃度達到48 mmol/L也只能夠將Form Ⅰ DNA降解至Form Ⅱ DNA，見圖2。

圖2 配合物1-3及其單核配合物(亞氨基二乙酸銅)切割pUC19質粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gelelectrophoresis of complexes 1,2, 3 and mononuclear complexes(Imino two copper acetate) cutting pUC19 plasmid DNA

2.3.2 活化氧物種捕捉劑存在下的pUC19質粒DNA切割：當加入DMSO時，配合物1-3的切割活性明顯降低，抑制率分別為91%，84% 和 48%;過氧化氫清除劑KI的加入同樣能夠顯著的降低配合物的切割活性，抑制率分別為78%，62%和 60%,而 NaN3的加入對于切割反應影響較小，說明單線態氧并非這類配合物的DNA切割過程中產生的活性氧中間。見圖3。

圖3 配合物在不同清除劑存在下的DNA切割Fig.3 Complexes in the presence of different scavenger cutting DNA

本實驗中的3個配合物Cu2+/Cu+氧化還原電位高低遵循的順序為：3>1>2，這與配合物的DNA切割效率一致。

3 討論

金屬配合物具有誘導DNA凝聚的潛力,帶正電的多核金屬配離子有可能誘導DNA發生可逆凝聚,成為一種新型基因載體,對基因治療具有重要的意義。金屬配合物和DNA相互作用的方式和機理的研究,對探索配合物在抗腫瘤藥物、分子生物學、生物工程技術及其他相關領域的應用具有非常重要的意義。在研究配合物與DNA相互作用的基礎上,通過適當的方法使DNA發生斷裂,這是獲取DNA的序列信息和阻止癌變基因復制的重要工作。本研究利用銅配合物進行合成新的配體1’-3’，在不同的ph值下配合物配體存在形式也不同。

配合物1-3在相同的Cu2+濃度下，切割效率明顯要高于亞氨基二乙酸銅，Form Ⅰ DNA消失時，相應的配合物1-3 Cu2+濃度分別為42，40和36 mmol/L；而配合物1在15 μmol/L的濃度下，50%的Form Ⅰ DNA可以轉變為Form Ⅱ DNA，配合物2可以將40%的Form Ⅰ DNA轉變為Form Ⅱ DNA，配合物3在10 μmol/L時就能將90%的Form Ⅰ DNA轉變成Form Ⅱ DNA；在配合物1，2，3的Cu2+濃度均為30 μmol/L時，剩余的超螺旋pUC19質粒DNA含量分別為44%、60%、9%，說明配位銅中心之間存在著協同作用,切割效率遵循以下順序：3>1>2。這個順序與配合物跟 DNA結合能力的順序相一致，說明配合物與 DNA結合能力的大小可能是影響DNA切割的主要因素[4-8]。但在配合物1’-3’中，情況與配合物1，2，3并不相同。配合物1’，2’，3’中，Form I DNA消失時，相應的配合物1’-3’ Cu2+濃度分別為2，1和9 mmol/L，這很顯然的說明了配合物1’-3’切割效率高于配合物1-3，可能由于結合能力的強弱所致。然而配合物2’對于 DNA 的切割并不能產生線性DNA(Form III DNA)，這不同于配合物2，說明它們對于DNA氧化切割機理不同[9-10]。需要引起注意的是配合物3’，它與DNA結合能力最強，但是切割效率卻是3者中最低的，螯合單元換為亞氨基二乙酸時，配合物3與DNA結合能力最強，切割效率在3者中最高。

本文合成了3個有機配體：N,N,N’,N’-間苯二甲胺基四乙酸(H4L1)、N,N,N’,N’-對苯二甲胺基四乙酸(H4L2)、N,N,N,N’,N’,N’-1,3,5-苯三甲胺基六乙酸(H6L3)，并利用這3個配體合成了3個多羧酸多銅配合物(1-3)并首次研究了多羧酸多銅配合物氧化切割DNA的能力，同時與其多吡啶多銅類似物(1’-3’)的切割活性比較探索了DNA氧化切割中多銅協同作用中的配位基團效應。配合物 1-3 與配合物 1’-3’的差別在于螯合配位基團由二-(2-吡啶基甲基)胺變為亞氨基二乙酸，基本螯合單元的改變讓配合物性質發生了變化。研究發現，3個多羧酸多銅配合物在等 Cu2+濃度下切割效率均高于相應的單核銅配合物，說明Cu2+中心之間存在協同作用，這與配合物 1-3相同[11]。配合物 3 在3者中的 DNA切割效率最高，配合物1次之，配合物2切割效率最低，這與它們的DNA結合能力相一致[12]。配合1-3與DNA結合能力遠低于配合物1’-3’，切割效率也遠低于1’-3’，但是配合物2可以誘導產生線性DNA，這種一點是配合物2’所不具備的。配合物3’與DNA結合能力最強，但是切割效率在1’-3’中確最低。因而對于DNA氧化切割，多羧酸多銅配合物與多吡啶多銅配合物所采用的機理并不相同[13]。通過加入不同的活性氧清除劑可以發現，配合物1-3采用Fenton機理氧化切割DNA，而配合物1’-3’采用的是非任意切割的DNA 結合的ROS機理。改變配合物螯合配位基團對于配合物性質有很大的影響，這些工作可以為合理的設計合成銅類核酸酶提供一個很好的指導。表明·OH在切割過程中起著重要作用，·OH的隨機擴散使Form I DNA轉變成Form II DNA，Form III DNA的出現說明配合物1-3與DNA采用一種特定的結合方式，在相同的配合物上產生兩個·OH自由基破壞鄰近的兩個脫氧核糖以產生線性DNA，這與上述的DNA強結合能力導致高切割效率相一致。通過對比DMSO和KI對配合物1和2的抑制率，可以看出配合物對于DNA的氧化切割主要采用以·OH為主要活性氧物種的Fenton機理。

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(編校：王冬梅)

Study on oxidative cutting DNA with pentanuclear copper complexes of imino acetic acid two aromatic derivatives

WU Lin-lin,LI Meng, HUANG Ting

(Department of Pharmacy, Armed Police Corps Hospital of Sichuan Province, Leshan 614000, China)

ObjectiveTo study effect of pentanuclear copper complexes of imino acetic acid two aromatic derivatives on oxidative cutting DNA.MethodsSynthesized complexes later, protonation constants and the stability constants of the complexes were determined by potentiometric titration method, the cutting DNA was studied by agarose gelelectrophoresis.ResultsUnder physiological conditions, complexes H4L1, H4L2, between H6L3 and Cu2+coordination capability was stronger; three carboxylic multi copper complexes in Cu2+concentration cutting efficiency were higher than the corresponding mononuclear copper complexes, synergistic effect exists between Cu2+Center; H6L3 complexes of the three DNA cut the highest efficiency, complex H4L1 was followed, complex H4L2 cutting efficiency was the lowest.ConclusionChange the complex chelating ligands has great influence on the properties of complex, which provides a theoretical basis for the design and synthesis of copper nucleases reasonable.

pentanuclear copper complexes; DNA oxidative cutting;artificial metallonucleases

吳琳琳，女，碩士，副主任藥師，研究方向：藥物化學，E-mail：wll13981398866@163.com。

O641.4

A

1005-1678(2015)03-0072-04