中藥菊花煎劑對小兒RSV感染A549細胞后趨化因子影響的研究

潘婷,朱亮

(蘇州大學附屬第二醫院 藥劑科，江蘇 蘇州 215000)

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中藥菊花煎劑對小兒RSV感染A549細胞后趨化因子影響的研究

(蘇州大學附屬第二醫院 藥劑科，江蘇 蘇州 215000)

目的 分析中藥菊花煎劑對小兒呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus ，RSV)感染氣道上皮細胞(A549細胞)后趨化因子的影響。方法 以近期蘇州大學附屬第二醫院收治的住院小兒確診RSV型肺炎患者64例作為研究對象，分析患兒感染RSV后的臨床病癥。建立RSV感染A549細胞模型，對感染后細胞進行細胞培養，加入中藥菊花煎劑和常規抗病毒藥觀察其對RSV感染細胞的存活率影響；用ELISA試劑盒測定并比較2組細胞液中趨化因子MCP-1及RANTEs的表達情況。結果 體外細胞培養實驗結果表明，中藥菊花煎劑有直接的抑制病毒生長復制的作用，且存在一定的正量效應；RSV感染A549細胞后，MCP-1和RANTEs表達或釋放明顯增多(P<0.05)，中藥菊花煎劑及抗病毒藥干預后，其表達明顯降低(P<0.05)，但是其總量仍顯著高于正常值。結論 中藥菊花煎劑能在一定程度上抑制RSV感染A549細胞釋放趨化因子RANTEs和MCP-1，從而起到減輕患兒氣道炎癥反應的作用。

中藥菊花煎劑；小兒肺炎；呼吸道合胞病毒；A549細胞；趨化因子

肺炎是威脅小兒身心健康的一類重要疾病， 又以病毒性肺炎為甚。在發展中國家，病毒性肺炎是兒童發病率最高的疾病占小兒住院疾病之首，也是6歲以下兒童死亡的重要因素[1]。小兒肺炎若未得到及時的診治，極易發生其他并發癥，如肺氣腫、肺不張等，給后續治療及預后帶來很大的影響[2]。此外，某些病原體所致肺炎與小兒支氣管哮喘發病密切相關，如呼吸道合胞病毒肺炎和支原體性肺炎[3]。目前，臨床上針對小兒肺炎多采用西醫抗病毒及對癥治療，而抗生素類藥物對小兒生長發育的副作用卻不容忽視。中醫中藥在治療病毒性肺炎上有其獨特的優勢，研究表明其不僅能抑制病毒生長還具有副作用小，調節兒童免疫能力等優點。但其具體作用機制仍未明確[4-5]。為此，本研究將利用蘇州大學附屬第二醫院病例資源，探討分析中藥菊花煎劑對防治RSV感染性肺炎的免疫機制尤其是對氣道炎癥的影響，為中醫治療病毒性肺炎提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 體外實驗所用氣道上皮細胞株(A549細胞)購于中山大學動物實驗中心；細胞培養液成分均為本實驗室自配(MEM中加入10%牛胎血清，濃度為100pg/mL的青霉素溶液及濃度為100pg/mL的鏈霉素溶液[6])；呼吸道合胞病毒(RSV)由本研究所病毒室提供。

1.2 儀器與試劑 二甲基亞楓(DMSO)和用于測定炎癥因子RANTES、MCP-1、MIP-1α表達及釋放量的相關酶聯免疫吸附分析(ELISA)試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養：培養基為含10%牛胎血清的MEM，分別加入青霉素和鏈霉素至100 pg/mL。加入A549細胞至25 cm2的培養瓶中，然后將培養瓶置于37 ℃，5%CO2恒溫孵箱培養，每隔2～3 d進行1次培養液更換，同時進行顯微鏡下觀察細胞生長及聚集情況，待細胞生長至融合狀態時停止培養，取出進行實驗。

1.3.2 A549細胞存活率的測定：采用MTT法測定感染RSV的A549細胞的存活率。分別測定藥物濃度為2、4、8、16、32、64和128 μg/L的細胞存活率。將細胞培養液上清液棄去，于培養板中加入濃度為5 mg/mL的MTT液50 pL/孔，置恒溫CO2培養箱中繼續培養2～3 h后，棄MTT上清，用PBS液洗3次，每孔加溶解液200 μL，手動均勻進行5～10 min的震蕩，觀察結晶情況，待其完全溶解后放置于酶標測定儀上，分別測定中藥菊花煎劑組、病毒唑組和細胞對照組細胞于570 nm波長處的光密度OD值，并根據細胞存活率[7-8]=藥物組平均OD570/細胞對照組平均OD570×100%，計算各組細胞存活率。

1.3.3 中藥菊花煎劑對感染RSV的A549細胞趨化因子的測定：將培養成層的A549細胞消化成單層細胞，并以0.1 mL/孔加入96孔微量細胞培養板中。接種RSV病毒后，加入含藥維持液，置于37 ℃，5%CO2恒溫培養箱中培養48 h，進行實驗。采用酶聯免疫吸附分析(ELISA)分別測定上清液中MCP-1和RANTEs的含量。

2 結果

2.1 我院近期患兒肺炎病原體感染情況 選取我院近期兒童肺炎患者共679例，進行病原體培養定型，結果表明，感染率最高的為肺炎支原體，共247例，占36.45%。本研究中選取感染率為9.40%的RSV感染患兒共64例，見表1。

表1 我院近期患兒肺炎病原體感染分布情況Tab. 1 The pathogen distribution in children with pneumonia recently in our hospital

2.2 中藥菊花煎劑對RSV的抑制作用 RSV感染氣道上皮細胞A549后表現為：細胞腫脹、變形、壁增厚及折光性減弱，并且可見到明顯的細胞融合現象，形成合胞體。測定細胞存活率結果表明：藥物濃度增加，細胞存活率下降，即病毒抑制率增高。見表1。

表1 中藥菊花煎劑對RSV的抑制作用Tab.1 Inhibition of traditional Chinese medicine chrysanthemum decoction on RSV

圖1 中藥菊花煎劑對RSV的抑制作用Fig.1 Inhibition of traditional Chinese medicine chrysanthemum decoction on RSV

2.3 中藥菊花煎劑對RSV感染A549后誘導RANTES釋放作用的影響 中藥菊花煎劑組RANTES的表達顯著低于其他2組(P<0.05)，見表2。

表2 中藥菊花對RSV感染A549細胞后誘導RANTES釋放作用影響Tab.2 Influence of RANTES release by Chinese medicine chrysanthemum of RSV infecting A549 cells

*P<0.05，與細胞對照組比較，compared with control group；#P<0.05，與病毒唑組比較，compared with virazole group

2.4 中藥菊花煎劑對RSV感染A549后誘導MCP-1釋放作用的影響 中藥菊花煎劑組MCP-1的表達顯著低于其他2組(P<0.05)，見表3。

表3 中藥菊花對RSV感染A549細胞后誘導MCP-1釋放作用影響Tab.3 Influence of MCP-1 release by Chinese medicine chrysanthemum of RSV infecting A549 cells

*P<0.05，與細胞對照組比較，compared with control group；#P<0.05，與病毒唑組比較，compared with virazole group

3 討論

肺部炎癥目前已被世界衛生組織列為全球最常見3種兒科疾病之一[9]。就我國情況來看，小兒肺炎發病率較高，且呈日益增長趨勢。若未經過及時的診治，小兒肺炎將發生各種并發癥，甚至哮喘等其他嚴重呼吸系統疾病[10]。西醫治療小兒肺炎常用的為病毒唑等抗病毒藥，此類藥效果顯著，但是對小兒生長發育有著極大的影響和副作用[11]。本文利用本院資源，研究中藥菊花煎劑對RSV感染A549細胞趨化因子的影響。

體外實驗結果顯示，中藥菊花煎劑對RSV感染后的A549細胞有明顯的抑制作用，當藥物濃度達到128μg/L時感染細胞的存活率即以降為41.9%，與細胞對照組的96.2%相比， 差異有統計學意義(P<0.05)

RANTEs是一種由T細胞表達和分泌的正常趨化因子，可作用于單核細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞等，但中性粒細胞不受RANTEs趨化作用[13-14]。此外，RANTEs還能促進自然殺傷細胞遷移和激活記憶T細胞、單核細胞。MCP-1與RANTEs屬于同一家族。研究已表明，RSV感染能促進RANTEs和MCP-1的表達和釋放[15]。Babara[16]研究顯示，體外實驗中感染RSV的A549細胞中趨化因子RANTEs、MCP-1和MCP-1α的mRNA和蛋白表達及釋放量均增加，并且與RSV感染的劑量和持續時間成正相關。

本實驗研究結果提示正常人體的氣道上皮細胞即可表達和釋放一定量的RANTES和MCP-l等趨化因子。當RSV感染人體A549細胞后會顯著增加趨化因子RANTES和MCP-l的表達量或釋放量，這與其他文獻[17-18]發表的研究結果相吻合，表明RSV感染性性肺炎可能通過刺激人體氣道上皮細胞釋放趨化因子RANTES、MCP-1，從而誘導大量炎性細胞，如單核細胞、嗜酸性粒細胞和巨噬細胞在患者氣道黏膜的趨化與聚集，進而造成被感染者持續而嚴重的氣道炎癥反應[19]。本實驗結果還表明通過中藥菊花煎劑干預，感染RSV患者體內RANTES、MCP-1的表達與釋放明顯降低，但較正常細胞組而言，仍顯著增加，提示臨床上中藥菊花煎劑治療RSV感染性小兒肺炎的機理不僅在于藥物抗病毒作用，更取決于其能在一定程度上抑制氣道上皮細胞表達和釋放RANTES、MCP-1等趨化因子，從而達到減輕氣道炎癥高反應性的作用。

[1] Thomas EE,Book LE.Comparison of two rapid methods for detection of respiratory syncytial virus (RSV) (Testpack RSV and ortho RSV ELISA) with direct immunofluorescence and virus isolation for the diagnosis of pediatric RSV infection[J]. J Clin Microbiol., 2003,(10):872-876.

[2] 朱瑩瑩，袁斌.中醫藥對小兒RSV感染的研究進展[J].浙江中醫藥大學學報，2014，(2)：227-229,232.

[3] 鄭璐璐,張貴君,王晶娟，等.野菊花藥效組分抗炎的生物效應研究[J].天津中醫藥，2011，28(3)：251-253.

[4] Korczak D,Dietl M,Steinhauser G.Effectiveness of programmes as part of primary prevention demonstrated on the example of cardiovascular diseases and the metabolic syndrome[J].GMS Health Technology Assessment,2011,7(3):231-234.

[5] 董琳，陳小芳，周曉聰，等.RSV毛細支氣管炎RANTES MIP-1α IL-8水平變化及相關性研究[J].浙江臨床醫學，2007，9(10)：1307-1308.

[6] 徐建亞，彭璐璐，汪受傳，等.金欣口服液對RSV感染細胞TLR4及TNF-α表達的影響[J].南京中醫藥大學學報，2012，28(6)：544-547.

[7] 吳瑩，李季倩，孟建，等.小檗堿抗流感病毒性肺炎小鼠肺組織炎性損傷的實驗研究[J].中國中醫藥信息雜志，2013，(9)：40-43.

[8] 任現志，汪受傳，韓新民，等.小兒病毒性肺炎中醫證治規律研究目標與思路[J].中醫雜志，2003，44(7)：544-545.

[9] 劉琳，董琳，徐月波，等.RSV 感染誘導的 RANTES、FKN、IP-10表達及 PPARγ激動劑抑制作用的體外研究[J].中華微生物學和免疫學雜志，2013，(9)：659-665.

[10] 艾軍，汪受傳，戴銘，等.關聯規則方法分析小兒病毒性肺炎熱與痰相關病機[J].中國中西醫結合雜志，2013，33(11)：1485-1488.

[11] 掌瑜，王勃，王實，等.血清降鈣素原檢測在兒童細菌性肺炎和病毒性肺炎鑒別診斷中的應用[J].徐州醫學院學報，2014，34(6)：407-408.

[12] 張晨月，張舒，吳瑩，等.犀角地黃湯合銀翹散對流感病毒感染的小鼠肺組織及大鼠肺微血管內皮細胞ICAM-1和VCAM-1表達的影響[J].中國病理生理雜志，2013，29(9)：1685-1690.

[13] 盧娜娜，劉琪，顧立剛，等.疏風宣肺方和解表清里方干預流感病毒性肺炎小鼠細胞凋亡的研究[J].醫學研究生學報，2013，26(11)：1134-1137.

[14] Casola A,Garofalo RP,Haeberle H，et al. Multiple cis Regulatory Elements Control RANTES Promoter Activity in Alveolar Epithelial Cells Infected with Respiratory Syncytial Virus[J]. J Virol ,2001,75(14):6428-6439.

[15] 艾軍，汪受傳，戴銘，等.中醫藥治療病毒性肺炎癥狀關聯療效評價[J].世界科學技術-中醫藥現代化，2014，(2)：228-233.

[16] Barbara OP, Antonella C,Tadahito S, et a1. Cell—specific expression of RANTES, MCP-1, and MIP-1α by lower airway epithelial cells and eosinophils infected with repiratory syncytial virus[J].J Virol,1998,72(6):4756-4764.

[17] 崔北勇,尹遠遠.六君子湯在小兒肺炎恢復期的臨床應用[J].中醫藥臨床雜志,2009,21(5):424-425.

[18] 陸宏進,董朝,殷妍,等.益氣健脾化痰法治療小兒肺炎恢復期肺脾氣虛證[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(16):318-322.

[19] Goldmann DA.Nosocomial viral infections: recent developments and new strategies[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2009,8(1):75-81.

(編校：王冬梅)

Effects of traditional Chinese medicine chrysanthemum decoction on Pediatric RSV infection after A549 cell chemotactic factor

PAN Yue-ting,ZHU Liang

(Department of Pharmacy, The Second Hospital Affiliated To Suzhou University, Suzhou 215000, China)

ObjectiveTo study effect of traditional Chinese medicine chrysanthemum decoction on RSV infection after A549 cells chemotactic factor.MethodsSubjects from The Second Hospital Affilated To Suzhou University in recent days, 64 cases of patients diagnosed with RSV effected pneumonia by clinical examination, RSV infection A549 cell model was established and the infected cells were cultured, chrysanthemums with TCM decoction and conventional antiviral observed its effect on RSV infection cell survival, compared two groups of cell SAP was determined by ELISA kit and the expression of RANTEs and chemokines MCP-1.ResultsChrysanthemum, according to the results of in vitro cell culture studies traditional Chinese medicine decoction had the effect of directly inhibit the growth of virus replication, and there were some positive effects RSV infected A549 cells, MCP-1 and RANTEs expression or release significantly increased (P<0.05). Chrysanthemum Chinese medicine decoction and antiviral drugs after the intervention, the expression of MCP-1 and RANTES reduced significantly (P<0.05), but overall volume was still significantly higher than the normal.ConclusionChrysanthemum Chinese medicine decoction can inhibit RSV infected A549 cells release chemokine RANTEs and MCP-1 to some extent, and then reduce the airway inflammation reaction of children.

chrysanthemum Chinese medicine decoction;pediatric pneumonia;respiratory syncytial virus(RSV);chemokines

潘玥婷，女，大專，藥師，研究方向：藥劑學，E-mail:zzy9904@163.com。

R245.81

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1005-1678(2015)03-0082-03