不同β-環糊精衍生物的恩替卡韋包合物的溶解度和溶出度研究

王鹛嵩,吳海濤,王敏,陳聲文

(1.海南省人民醫院 藥學部，海南 海口 570311；2.海南百信藥業有限公司制藥廠，海南 海口 570216)

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不同β-環糊精衍生物的恩替卡韋包合物的溶解度和溶出度研究

王鹛嵩1,吳海濤1,王敏1,陳聲文2

(1.海南省人民醫院 藥學部，海南 海口 570311；2.海南百信藥業有限公司制藥廠，海南 海口 570216)

目的 研究和制備了不同β-環糊精衍生物的恩替卡韋包合物，探討不同包合物對恩替卡韋溶解度和溶出度的影響。方法 建立標準回歸方程，采用磁力攪拌法、研磨法和超聲法制備包合物，以包合率為目標，通過考察摩爾比、包合溫度、包合時間、攪拌速率等因素對包合的影響，從而得到最佳包合工藝條件；采用高效液相色譜法測定不同包合物的溶解度并用小杯法考察了體外溶出度。結果 回歸方程為A=1.026×106C+4248.8，R2=0.9999(n=6)，在0.497～4.97 μg/mL范圍內的線性關系良好；得到的最佳包合方法為磁力攪拌法，最佳包合工藝條件為A摩爾比為1︰1，攪拌速率300 r/min，包合時間為4h，包合溫度50 ℃；恩替卡韋在不同的β-環糊精衍生物包合后得到白色疏松狀粉末物質。ETV、β-CD-ETV、HP-β-CD-ETV、 RM-β-CD-ETV、2，6-DM-β-CD-ETV的溶解度分別為2.51、13.4、18.9、37.6、89.5 g/L，采用不同的環糊精衍生物都具有顯著的增溶作用。恩替卡韋的不同環糊精衍生物的包合物的溶出度為ETV<β-CD-ETV

恩替卡韋；β-環糊精及其衍生物；包合物；溶解度；溶出度

臨床研究證實，恩替卡韋(entecavir, ETV)是一種強效選擇性鳥嘌呤核苷類似物，具有顯著的抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的活性[1-3]。ETV較拉米夫定(lamivudine，LAM)具有更加顯著的病毒抑制作用，幾乎沒有副作用，且耐藥性很低，在治療慢性乙型肝炎藥物中被認為有很好的臨床應用前景[4-6]。由于恩替卡韋是難溶性藥物，一般的片劑對于藥物的溶出有一定的影響。利用β-環糊精(β-cyclodextrin，β-CD)和β-CD衍生物與藥物包合的研究相當廣泛[7-10]。β-CD及其衍生物是內親水外疏水的“錐筒”結構，能有效包合一些難溶性的藥物并增加其溶解性和溶出度。β-環糊精不僅能與其空穴大小相容性的化合物形成包合物，也能通過難溶性藥物上某些特定基團或側鏈插入環糊精的空穴形成包合物來增加其溶解性和溶出度。β-CD對一些不溶性藥物有很好的包合作用，但分子中C2和C3羥基之間形成分子內氫鍵而導致其自身水溶性變差，采用羥丙基-β-環糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD)、甲基-β-環糊精(methyl-β-cyclodextrin，RM-β-CD)、2，6-二甲基-β-環糊精(2，6- dimethyl-β-cyclodextrin，2，6-DM-β-CD)破壞了分子內氫鍵，大大地提高了其水溶性和親水性。本實驗采用上述4種材料包合恩替卡韋，研究其對恩替卡韋溶解性和溶出度的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 1260型高效液相色譜儀、1260色譜工作站和DAD檢測器(安捷倫公司)；BS110S/BT125D電子分析天平、PH-10型PH計(賽多利斯公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市科瑞儀器有限公司)；DZF-6020真空干燥箱(北京陸希科技有限公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海躍進醫療器械廠)；ZRS-8G智能溶出試驗儀(天津市天大科技有限公司)。

1.2 藥品與試劑 恩替卡韋原料藥(海南中和藥業有限公司，批號： 201403)；恩替卡韋對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：201109-201408)；β-環糊精(上海伯奧生物科技有限公司)；羥丙基-β-環糊精、甲基-β-環糊精、2,6-二甲基-β-環糊精(上海伯奧生物科技有限公司)；甲醇、乙腈(AR)；去離子水；0.1M鹽酸溶液(自配)。

1.3 方法

1.3.1 恩替卡韋標準曲線的建立：HPLC法測定的色譜條件： YMC-Pack Pro C18柱(250×4.6 mm，5 mm)，以乙腈-水(3︰97)為流動相A，乙腈為流動相B，檢測波長為254 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃。

精密稱取25 mg(以無水物計)恩替卡韋對照品，置于100 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。再精密量取10 mL，置于50 mL容量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻。精密量取此溶液0.5、1.0、2.0、2.5、3.0和5.0 mL分別置于50 mL容量瓶中，加流動相A稀釋至刻度。制成系列濃度的線性溶液。分別量取各線性溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算峰面積。

1.3.2 包合方法的選擇：目前制備環糊精包合物常用且操作方便的方法有磁力攪拌法、研磨法和超聲法[11]，本實驗以羥丙基-β-環糊精為代表，按物質的量比2︰1精密稱取羥丙基-β-環糊精和恩替卡韋3份，分別用磁力攪拌法、研磨法和超聲法制備包合物和用無水乙醇和水來洗滌3次包合物，使游離恩替卡韋和未包合的環糊精洗凈。

1.3.3 包合物的制備：稱取羥丙基-β-環糊精(以2-羥丙基為代表)適量，置于50 mL圓底燒瓶，加入一定量的蒸餾水形成飽和溶液。在恒溫加熱磁力攪拌器升溫至50 ℃，緩慢滴入100 mg已溶于適量甲醇的恩替卡韋，恒溫攪拌4 h，冷卻后放入冰箱冷藏24 h，抽濾，用少量的甲醇洗滌濾餅3次，除去游離的恩替卡韋，放入50 ℃真空干燥箱干燥6 h，其他的3種β-環糊精也做同樣處理。

1.3.4 包合物的熔點測定：對4種環糊精衍生物和4種衍生物的包合物進行熔點測定，包合物熔點與4種環糊精衍生物和恩替卡韋熔點明顯不同，證明了包合物為新的物相。

1.3.5 包合物制備最佳工藝優化：本實驗以羥丙基-β-環糊精為例，以摩爾比、包合溫度、包合時間和攪拌速率為因素，分別進行了單因素試驗，結合單因素的分析進行了以摩爾比、包合溫度、攪拌速率包合時間和為因素設計了3水平4因素L9(34)正交試驗，見表1。

表1 正交設計因素表Tab.1 Orthogonal design factors and levels

1.3.6 溶解度的測定：分別精密稱取50 mg最佳工藝條件制備的4種恩替卡韋包合物和恩替卡韋，置于6支10 mL的具塞試管，加入10 mL去離子水，超聲10 min后，使之形成過飽和溶液，放入37 ℃溫水浴中孵育24h后用0.45 μm的微孔過濾，分別取1 mL的濾液用流動相A稀釋至100 mL，分別量取各溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積。然后對照恩替卡韋標準曲線，計算出各包合物和恩替卡韋的溶解度及增溶的效果，結果為3次測定的平均值。

1.3.7 溶出度的考察：取恩替卡韋及其不同的β-環糊精衍生物包合物以0.1 mol/L鹽酸溶液為溶出介質，照溶出度測定法，溫度在37 ℃±0.1 ℃，轉速50 r/min，分別于5、10、15、20、30和45 min吸取溶液適量(同時補加等量同溫溶出介質)，用0.45 μm濾膜過濾，續濾液作為供試品溶液，量取上訴供試品溶液及對照品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按照外標法以峰面積計算溶出量，繪制溶出曲線。

2 結果

2.1 恩替卡韋標準曲線的建立 以恩替卡韋濃度為橫坐標，主峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程為A=1.026×106C+4248.8，R2=0.9999(n=6)。說明恩替卡韋在0.497～4.97 μg/mL范圍內與峰面積有良好的線性關系。見圖1。

圖1 恩替卡韋的標準曲線圖Fig.1 Standard curve of entecavir

2.2 包合方法的選擇 測定3種方法制備的包合物的包合率，結果表明：磁力攪拌法的包合率最高，故選擇此方法來制備恩替卡韋包合物。見圖2。

圖2 3種包合方法比較Fig.2 Comparison of three inclusion methods

2.3 包合物的制備 得到白色疏松狀粉末物質非晶型粉末狀，安全性好，局部刺激性。

2.4 4種環糊精衍生物及其包合物的熔點測定 恩替卡韋及其包合物的熔點見表1。

表1 恩替卡韋及其包合物的熔點Tab.1 Melting points determination of entecavir and its inclusion compound

2.5 包合物制備最佳工藝優化 由極差(R)分析可以看出，各因素對包合效果的大小順序為A>C>B>D，即投料比>包合時間>包合溫度>攪拌速率。其中投料比是影響包合的主要因素，包合時間其次，攪拌速率的影響最小。根據包合率分析可知，最佳包合工藝條件為A1B2C2D2，即摩爾比為1︰1，攪拌速率300 r/min，包合時間為4 h，包合溫度50 ℃，羥丙基-β-環糊精包合恩替卡韋的最高包合率為48.93%，見表2。對于實驗中用到其他的3種環糊精衍生物對恩替卡韋包合物都做了同樣的單因素的考察，也都設計了4因素3水平的正交試驗，從而得到各物質的包合最佳工藝，見圖3。

表2 正交試驗結果Tab.2 Results of orthogonal test

圖3 4種包合物質的包合率比較Fig.3 Comparison of inclusion rates of four inclusion complexes of β-CD with entecavir

由圖3可知，以包合率為目標，其對恩替卡韋的包合工藝為：2，6-DM-β-CD>RM-β-CD>HP-β-CD>β-CD。環糊精衍生物的親脂性與其包合能力相關的，恩替卡韋是一種疏水性的物質，而這4種物質的親脂性為2，6-DM-β-CD>RM-β-CD> HP-β-CD>β-CD，因此2，6-DM-β-CD對恩替卡韋的包合效果是最好的。

3.6 溶解度的測定 恩替卡韋-2，6-二甲基-β-環糊精溶解度最大，較之恩替卡韋在水中的溶解度增加了35.6倍，見圖4。

圖4 恩替卡韋及其包合物在水中的溶解度Fig.4 Solubility of entecavir and its inclusion compound in water

3.7 溶出度的考察 恩替卡韋原藥的溶出速度較低，經β-環糊精包合后，溶出速度有顯著的提高，表明原藥形成包合物后，可能形成分子膠囊，增加了疏水性藥物的溶解度，從而加快其溶出，見圖5。

圖5 恩替卡韋及其包合物的溶出曲線Fig.5 Dissolution curve of entecavir and its inclusion compound

3 討論

β-環糊精是近年來備受關注的新型藥物包合材料，這主要是由于β-環糊精具有特殊的分子結構，即呈閉合筒狀結構，外部是親水性的表面，內部則是一個具有一定尺寸的手性疏水管腔，能包合一定大小的藥物分子，形成一種特殊的包合物，從而改變藥物的特性[12-13]。近年來，有關β-環糊精及其衍生物的研究已取得了顯著的發展[14]。β-環糊精分子中C2和C3羥基之間形成分子內氫鍵而導致其水溶性差，在水中β-環糊精的溶解度僅為1.85 g，使之在許多應用上受到限制[15]。而β-環糊精甲基化后形成的二甲基β-環糊精具有高水溶性，在水中溶解度達55 g，比天然β-環糊精在水中溶解度提高了近30倍。當然也增加了包合藥物在水中的溶解度。羥丙基-β-環糊精的特性為水溶性大(>50%)，產品呈非晶型粉末狀，安全性好，局部刺激性小。羥丙基功能團具親水性，所以羥丙基環糊精具有水溶性和親水性的性質，親水性是其最大的優點，易與生物環境相容，還因表面活性較小，不易引起在動物體內的溶血,生物安全性更好。羥丙基-β-環糊精分子呈中空截頭圓錐狀，中間為疏水性空腔，與藥物客分子形成包合物之后可完全或部分遮掩疏水性藥物分子中的某些基團，從而不但可以提高藥物本身的穩定性，同時又可減低或消除藥物對機體的某些毒副作用。β-環糊精衍生物具有比母體環糊精更優良的特性，能解決許多技術難題，是改進藥劑處方的有效輔料。

本實驗采用磁力攪拌法制備4種β-環糊精-ETV包合物，通過3水平4因素L9(34)正交試驗，得到最佳包合工藝條件。包合物的這種特殊分子結構能顯著增加恩替卡韋的溶解度和提高溶出度，這為進一步開發恩替卡韋新劑型提供了理論依據。

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(編校：王冬梅)

Study on different β- cyclodextrin and its derivatives for solubilization and dissolution of entecavir

WANG Mei-song1,WU Hai-tao1,WANG Min1,CHEN Sheng-wen2

(1.Department of Pharmacy, Hainan People’s Hospital, Haikou 570311, China; 2.Hainan Pashun Pharmaceutical Co., Ltd., Pharmaceutical Factory, Haikou 570311, China)

ObjectiveTo prepared inclusion complex of β-cyclodextrin (β-CD) and its derivatives (methyl -β-cyclode- xtrin, 2,6-dimethyl -β- cyclodextrin, hydroxypropyl -β-cyclodextrin) with entrcavir,and explore effect of different inclusion complex on the solubility and dissolution of entecavir.MethodsRegression equation was established,prepared the inclusion complexes by a magnetic stiring method,grinding method and ultrasonic method.While inclusion rate was an index,the effects of reaction process was inquired by mole ratio, inclusion temperature, inclusion time and stirring rate and the most suitable method and technology of inclusion was optimized.Determinated the solubility with HPLC method and investigated in vitro dissolution with a small cup method.ResultsThe regression equation was A=1.026×106C+4248.8, R2=0.9999 (n=6), in the range of 0.497～4.97 g/mL, linear relationship was good.The best inclusion method was magnetic stirring, the best process conditions were: mole ratio was 1︰1, stirring speed was 300 r/min, inclusion time was 4 hours, inclusion temperature was 50 ℃.The four inclusion complexes all were white loose powder materials.The solubility of ETV，β-CD-ETV，HP-β-CD-ETV，RM-β-CD-ETV，2,6-DM-β-CD-ETV were 2.51, 13.4, 18.9, 37.6 and 89.5 g/L.The dissolution rates was ETV<β-CD-ETV

entecavir;β-cyclodextrin and its derivatives; inclusion complex; solubility;dissolution

王鹛嵩，女，本科，副主任藥師，研究方向：醫院藥學，E-mail：mrswangdoctor@163.com。

R944.4; R943.3

B

1005-1678(2015)03-0172-04