首烏方對左旋多巴誘導異動癥大鼠的干預作用及其機制

焦 ,劉洋,孫丹丹,王丹巧Δ,梁嶸

(1.中國中醫科學院 醫學實驗中心 北京市中醫藥防治重大疾病基礎研究重點實驗室，北京 100700； 2.北京中醫藥大學 基礎醫學院，北京 100029)

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首烏方對左旋多巴誘導異動癥大鼠的干預作用及其機制

(1.中國中醫科學院 醫學實驗中心 北京市中醫藥防治重大疾病基礎研究重點實驗室，北京 100700； 2.北京中醫藥大學 基礎醫學院，北京 100029)

目的 探討首烏方對左旋多巴誘導的異動癥(levodopa induced dyskinesia，LID)大鼠的干預作用及其機制。方法 32只雄性SPF級SD大鼠，隨機分為4組：假手術組(sham operation，SO組)、異動癥模型組(levodopa induced dyskinesia，LID組)、首烏方高劑量組(shouwufang-high dose，SWF-H組)、首烏方低劑量組(shouwufang-low dose，SWF-L組)，每組8只。單側雙位點注射6-羥基多巴胺造成PD模型后，灌胃給予多巴絲肼(30 mg/kg)22 d誘發LID，首烏方劑量組同時灌胃(SWF-H含生藥27 g/kg，SWF-L含生藥18 g/kg)。觀察各組LID發病率并進行動物AIM評分；清醒自由活動狀態下腦內紋狀體微透析、水楊酸捕獲羥自由基方法采樣，高效液相-電化學檢測動態觀察病變靶器官細胞外液中羥自由基指標(2,3-DHBA、2,5-DHBA)的濃度變化；檢測大鼠體內超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)水平的變化。結果 首烏方可明顯降低大鼠LID的發病率及AIM評分，降低紋狀體細胞外液2,3-DHBA及2,5-DHBA的濃度、并顯著降低血清內MDA的水平。結論 首烏方可以改善大鼠LID的行為學指標，有預防及干預LID的作用，其機制可能與減輕整體特別是病變靶器官的氧化應激損傷有關。

左旋多巴誘導異動癥；氧化應激；首烏方；微透析

左旋多巴(levodopa，L-DOPA)是臨床上治療帕金森病(parkinson’s disease，PD)的“金標準”用藥，對大多數患者可取得顯著療效，然而長期用藥后則會出現副作用或并發癥。L-DOPA誘導的異動癥(levodopa-induced dyskinesia， LID)是其長期治療過程中普遍出現的嚴重問題。累計資料分析顯示L-DOPA治療4～6年后，約40%的患者會出現LID，治療9～15年后，發生率可上升到90%[1]，而且隨著疾病的加重和治療時間的延長，LID的程度加重，發生頻率進一步增加，因而限制了L-DOPA的長期臨床應用。

國內外許多學者對于LID進行了大量研究，其病理生理機制至今仍不十分明確[2-4]。研究表明PD是LID的發病基礎，PD的嚴重程度及治療時L-DOPA的脈沖樣刺激對LID發生發展有直接影響[5]。而不論在PD的進展或LID的發病機制中，氧化應激損傷均參與其中并發揮重要的作用[6-7]。

由于LID目前的治療方法有限，應用長效多巴胺(dopamine，DA)制劑、神經保護劑、谷氨酸拮抗劑、抗精神病藥、立體定向蒼白球損毀術以及丘腦底核或蒼白球內側部的腦深部電刺激術等，效果并不滿意且存在一定的副作用，因此，如何找到干預和治療LID的有效措施，是PD治療中急需解決的臨床問題。

首烏方(Shouwufang，SWF)由首烏、鹿茸、天麻、鉤藤等中藥組成，補益肝腎、強筋壯骨、息風止顫。臨床研究表明，本方在配合多巴絲肼治療PD患者時，可以提高多巴絲肼的臨床療效，減少多巴絲肼的用量[8]。本課題組既往的實驗研究顯示，SWF可提高PD大鼠紋狀體細胞外液DA遞質的水平，減少外源性L-DOPA引起的血液、腦細胞外液藥物濃度的波動[9]，提示了干預LID的可能性。因此，本研究擬在PD基礎上在LID大鼠模型，并采用水楊酸捕獲羥自由基的腦內微透析技術手段，通過觀察SWF對其行為學指標、活體靶器官細胞外液及整體氧化/抗氧化物質水平的影響，探討SWF對LID的干預作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：雄性SD 大鼠，32只，體質量200～250 g，SPF級，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號：11400700022793。

1.1.2 藥品與試劑：多巴絲肼片(madopar，每片0.25 g，含L-DOPA 200mg與芐絲肼50 mg)購自上海羅氏公司；阿樸嗎啡購自中國食品藥品檢定研究所，批號100839；首烏方(何首烏20 g，鹿茸3 g，天麻10 g，鉤藤15 g，厚樸15 g等中藥組成)煎劑為本實驗室自制，3次水煎液合并濃縮為生藥量3.6 g/mL。水楊酸鈉、6-羥基多巴胺(6-OHDA)、辛烷磺酸鈉、2，3-二羥基苯甲酸(2,3-DHBA)、2，5-二羥基苯甲酸(2,5-DHBA)均購自Sigma公司，乙腈，乙酸，磷酸和甲醇購自Fisher公司。6-OHDA和阿樸嗎啡分別溶解于生理鹽水中，避光保存。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)測試盒購自南京建成科技有限公司。

1.1.3 儀器：微透析系統CMA/12腦部探針(透析膜長4 mm)及探針套管、CMA/402微量泵、CMA/470低溫樣品自動收集器，清醒動物活動裝置(瑞典CMA公司)。手術使用設備：大鼠腦立體定位儀STRONG8003、動物體溫維持儀269001、顱鉆/90-102(深圳瑞沃德公司)。高效液相色譜檢測系統(德國Sykam S-2100)。

1.2 方法

1.2.1 動物造模、給藥及微透析過程:6-OHDA制備PD大鼠模型[10-11]：大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉后，頭顱水平位固定在腦立體定位儀上，參照大鼠腦立體定位圖譜確定黑質致密部(substantia nigra pars compacta，SNc)，中腦腹側被蓋部(ventral tegmental area，VTA)三維坐標位置。SNc：A：-4.8 mm，R：+2.0 mm，V：-8.0 mm；VTA：A：-4.8 mm，R：+1.2 mm，V：-8.0 mm。每個位點注射6-OHDA 生理鹽水(含維C)8 μL(2 μg/μL)，SO組注射等量生理鹽水。

分組及給藥：PD大鼠隨機分為LID組(給予多巴絲肼30 mg/kg)，SWF-H組(多巴絲肼30 mg/kg+SWF 27 g/kg)，SWF-L組(多巴絲肼30 mg/kg + SWF 18 g/kg)，灌胃給藥每天1次，連續22d，SO組灌胃相應體積的純凈水。每組8只大鼠。最后1次異常不自主運動(abnormal involuntary movement, AIM)評價后麻醉大鼠，于紋狀體內(striatum：A：+0.2 mm，L：+3 mm，V：-7.5 mm)埋入探針套管，次日在大鼠清醒自由活動狀態下插入腦探針，進行微透析取樣。微透析過程：先以生理鹽水平衡1 h后換為5 mmol/L水楊酸鈉林格液以捕獲紋狀體細胞外液的羥自由基；以2 μL/min的速度灌流，每30 min收集1 管，取前3 管測定的數值均值作為基礎水平(0 min)，然后灌胃最后1次藥物或純凈水，并認每30 min 收集1 管透析液直至240 min。微透析樣品采用高效液相-電化學檢測方法分析。探針在使用前測定體外回收率，按此折算透析液中各種檢測物質的濃度。微透析結束后麻醉大鼠，取腹主動脈血，4 ℃低溫過夜后離心取上清液。

1.2.2 行為學評價：6-OHDA造模術后21 d，腹腔注射0.5 mg/kg阿樸嗎啡，記錄1 h內大鼠向健側旋轉圈數，大于100圈每小時為PD模型制作成功。

LID的行為學評價采用AIM評分：分別就前肢及口面部不自主運動、軸性及旋轉運動進行評定[12]，根據其嚴重程度劃分為5個等級(0～4分)，其中0分：無；1分：偶爾出現；2分：經常出現；3分：持續存在，刺激使之停止；4分：持續存在，刺激也不能使之停止。每7 d評價1次，總計評價4次21 d。每次評價過程如下：口服多巴絲肼后每30 min記錄一次分數，至給藥后120 min。AIM分數為4個時間點評價分數的總和，最高值為64分。

1.2.3 高效液相色譜-電化學(HPLC-ED)法測定2,3-DHBA，2,5-DHBA濃度。檢測方法參照本實驗室以前的研究[13]。Sykam C18分析柱(2.1 mm×100 mm，3 μm)。Antec Decade ⅡSDC電化學檢測器。流動相：乙二胺四乙酸二鈉(0.027 mmol/L)、辛烷磺酸鈉(0.74 mmol/L)、氯化鉀(2 mmol/L)、磷酸二氫鈉(100 mmol/L)、甲醇(15%)、乙睛(1%)、乙酸(0.05%)。流速0.2 mL/min，柱溫：30 ℃，工作電壓0.52 V，進樣量20 μL。

1.2.4 SOD及MDA檢測：MDA測定利用硫代巴比妥酸比色法，SOD采用黃嘌呤氧化酶法測定。實驗步驟按照南京建成試劑盒說明書進行操作。

2 結果

2.1 首烏方對LID大鼠行為學的影響 給SO組大鼠灌胃生理鹽水，無異常動作發生；多巴絲肼反復用藥，誘發了PD大鼠出現異常不自主運動——LID：主要表現為軸性肌張力障礙，頸部和軀干上部向毀損對側扭動，甚至不能保持平衡；毀損對側上肢或下肢異常不自主、無目的運動；對側旋轉等。與SO組相比，LID組AIM評分在7、14、21 d顯著升高(P<0.05，P<0.01)； SWF-H組則在21 d顯著降低了這一指標，僅為LID組的30%左右(P<0.01)，見表1。動態觀察AIM評分>20的嚴重LID的發生率， LID組在21 d達到75.0%；而SWF-L組和SWF-H組分別為50.0%，12.5%，見表2。

表1 SWF對LID大鼠AIM評分的影響,分)Tab.

*P<0.05，**P<0.01，與SO組相比，compared with SO group；#P<0.05，與LID組相比，compared with LID group

表2 各組嚴重LID發生率(AIM評分>20，%)Tab.2 The incidence of severe LID(AIM score>20，%)

2.2 SWF對LID大鼠紋狀體細胞外液2,3-DHBA和2,5-DHBA濃度的影響 采用水楊酸捕獲法，使腦內極不穩定的羥自由基形成穩定的2,3-DHBA和2,5-DHBA，通過HPLC-EDC方法檢測。結果可以看到0～240 min內，LID組2,3-DHBA濃度一直處于較高水平，與SO組相比，有6個時間點其升高有統計學意義(P<0.05，P<0.01)；SWF-L組和SWF-H組在觀察時間內一直低于LID組，其中SWF-H組有1個時間點降低有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 首烏方對LID大鼠紋狀體細胞外液2,3-DHBA的影響*P<0.05，**P<0.01，與SO組相比;##P<0.01，與LID組相比Fig.1 Effect of SWF on extracellular concentration of*P<0.05，**P<0.01，compared with SO group；##P<0.01，compared with LID group

LID與SWF 2組的2,5-DHBA濃度均升高。與SO組相比，LID組，在除240 min外其余各點均顯著升高(P<0.05，P<0.01)；SWF-L組在0～240 min內各時間點均高于SO組(P<0.05，P<0.01)；SWF-H組有4個時間點顯著高于SO組(P<0.05，P<0.01)，但與LID組間差異無統計學意義。見圖2。

圖2 首烏方對LID大鼠紋狀體細胞外液2,5-DHBA濃度的影響 *P<0.05，**P<0.01，與 SO group相比較Fig.2 Effect of SWF on extracellular concentration of *P<0.05，**P<0.01，compared with SO group

2.3 SWF對LID模型大鼠血中SOD活力和MDA濃度的影響 LID組大鼠血中MDA濃度為(4.7±0.9)nmol/mL，明顯高于SO組(P<0.01)，與LID組比較SWF高、低組MDA水平顯著降低(P<0.01)。LID組、SWF-L組和SWF-H組的SOD活力分別為(280.8±13.0) U/mL，(291.1±64.1) U/mL及(251.2±9.1) U/mL；高于SO組的(239.1±14.1)U/mL，但各組之間差異無統計學意義。見圖3。

圖3 首烏方對LID大鼠血中MDA濃度(A)和SOD活力(B)的影響**P<0.01，與SO組相比較；##P<0.01，與LID組相比較Fig.3 Effect of SWF on MDA concentration (A) and activity of**P<0.01，compared with SO group；##P<0.01，compared with LID group

3 討論

LID是L-DOPA治療PD過程中出現的嚴重并發癥，皮質-基底神經節-丘腦皮層環路是其發生的結構基礎，由于該環路受多種神經元、神經遞質、受體的調控，機制異常復雜[14]。近年來，對于LID的突觸前機制、突觸后可塑性、GABA 能和谷氨酸能神經元及非多巴胺能調節因子等機制研究報道較多，取得了新進展[15-16]。而本研究從氧化應激途徑探討在PD治療中與L-DOPA有協同作用的中藥SWF對LID的干預作用，為LID的防治提供新的思路。

多數研究表明，氧化應激損傷參與PD的進展并進而參與LID的發生機制，基礎研究最常使用的6-OHDA造成的動物模型即模擬了PD的氧化應激損傷機制[17]。本研究應用6-OHDA所致PD基礎上的LID大鼠模型，是在6-OHDA神經毒性、氧化應激損傷基礎上，附加L-DOPA反復波動性刺激誘發的。模型在PD階段，黑質、紋狀體的氧化/抗氧化功能已失平衡，過度產生的高活性及毒性的活性氧、羥自由基等，與細胞膜上的不飽和脂肪酸形成脂質過氧化物，破壞了生物膜的結構，改變了對離子的通透性、受體的功能等，生物酶活性喪失，線粒體、溶酶體等細胞器裂解，造成DA能神經元損傷或死亡[18]。在此基礎上，外源性L-DOPA異常波動性刺激，進一步改變了基因表達、信號轉導及神經元可塑性，使本已失衡的DA能環路功能更加異常。最近有研究甚至提出，L-DOPA長時間給藥后加重PD患者DA神經損傷的可能原因是其在代謝過程中產生內源性6-OHDA[19]，因此L-DOPA自身代謝產生的活性氧和自由基等更加重了氧化應激損傷，促進PD的進展及LID的發生[20]。因此，靶器官氧化應激指標的觀察，對于LID病理生理學和藥理學研究具有極其重要的意義。

羥自由基是氧自由基的一種，在研究中經常被用于代表性觀測指標。由于羥自由基在活體腦內壽命極短，性質活潑，產生后即在該部位造成神經元損害并隨之迅速代謝，故難于直接測定，以往測定腦勻漿中羥自由基的方法也具有較大的局限性。本實驗采用水楊酸捕獲羥自由基的微透析采樣法，使半衰期極短、直接檢測困難的羥自由基在活體內被水楊酸捕獲而形成穩定的2,3-DHBA和 2,5-DHBA，經HPLC電化學方法檢測。該方法能夠反映LID疾病模型動物在清醒、自由活動狀態下病變靶組織細胞外液中羥自由基水平的動態變化，使氧化應激損傷的化學研究更真實客觀。

本實驗中，LID組大鼠出現運動、肌張力障礙等行為學癥狀，病變靶器官紋狀體細胞外液的羥自由基指標2,3-DHBA和2,5-DHBA水平明顯升高，反映了局部氧化應激損傷的嚴重程度。整體受自由基攻擊程度的氧化物指標MDA水平在LID組異常增高，并反應性地引起抗氧化物SOD水平升高。SOD在胞漿和線粒體中分別以Cu/ZnSOD及MnSOD的形式存在，使超氧自由基歧化為水，以對抗氧化損傷[21]。有報道：使用酶學與原位雜交技術發現PD患者黑質部SOD水平增高[22]，認為這種改變可能為代償性反應，與本實驗結果一致，也提示在PD和LID的機制中，氧化與抗氧化水平動態變化具有重要意義。

中藥SWF在本實驗中顯示了可明顯減輕大鼠LID的發病率及AIM評分、降低紋狀體細胞外液2,3-DHBA及2,5-DHBA的濃度，并顯著降低血漿內MDA水平的效果。提示SWF可能直接或通過減緩L-DOPA代謝而間接抑制靶器官細胞外液羥自由基指標、調節整體氧化/抗氧化功能動態平衡發揮抗氧化作用，減輕病變局部腦組織的氧化應激損傷，改善失衡的DA能環路功能，從而干預了PD的進展和LID的形成和維持機制，表現為模型動物LID發病率降低和運動障礙程度減輕。

中醫學將PD、LID產生的震顫、舞蹈癥、手足徐動癥等歸屬于顫證、震掉、痙病范疇，辨證多為肝腎陰虛、風痰阻絡、肝郁血瘀、氣血兩虛等。SWF以入肝腎兩經的首烏、鹿茸為主藥，補益肝腎、強筋壯骨；輔以天麻、鉤藤平肝熄風；佐以厚樸下氣消痰，使以川芎引藥上行入腦。諸藥合用，共奏補肝腎、益精血、祛風止顫之效。因此，可以說首烏方是在中醫理論指導下，切中PD、LID中醫病機的合理中藥組方。現代藥理學研究顯示：首烏、鹿茸、天麻、鉤藤具有抑制血清、腦內過氧化脂質生成，或抑制腦內單胺氧化酶-B、增強抗氧化能力的作用[23-26]。本課題組前期的研究也證實：SWF在6-OHDA所致的PD大鼠模型中，抑制L-DOPA引起的腦組織內羥自由基升高[9]。進而采用清醒自由活動的PD模型大鼠腦內和血液雙位點同步微透析-HPLC檢測技術，觀察到SWF不僅抑制PD模型大鼠紋狀體細胞外液羥自由基產生，尚可增加DA遞質的濃度、平緩外源性L-DOPA投與產生的波動，并升高L-DOPA的血藥濃度[9, 27]。這也為本方干預PD及LID的作用機制提供了更多的藥理學依據。

綜上所述，本研究采用了PD基礎上的LID大鼠模型及水楊酸捕獲羥自由基的腦內微透析技術手段，通過觀察SWF對其行為學指標、活體靶器官細胞外液及整體氧化/抗氧化物質水平的影響，證明了氧化應激損傷參與了LID的發生機制，SWF通過減輕整體特別是病變靶器官的氧化應激損傷，改善LID大鼠行為學癥狀、減少了LID發病率。SWF抗氧化作用的分子機制和形態學研究尚待進一步進行。

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(編校：王冬梅)

Effect and mechanism of ShouwuFang on rats with levodopa-induced dyskinesia

JIAO Yue1,LIU Yang1,SUN Dan-dan1,WANGDan-qiao1Δ,LIANG Rong2Δ

(1.Experimental Research Center, China Academy of Chinese Medicine Science, Key Laboratory of Basic Research on TCM Prevention and Treatment of Major Diseases, Beijing 100700, China; 2.School of Basic Medical Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

ObjectiveTo investigate the effect of ShouwuFang (SWF) on levodopa-induced dyskinesia (LID) and its mechanism.Methods32 SD rats were randomized into 4 group: sham operation(SO) group, LID group, SWF low dose (SWF-L) group, and SWF high dose (SWF-H) group.Established the PD model by unilateral perfusion of 6-OHDA in two positions.The PD rats were administrated madopa (30 mg/kg), madopa (30 mg/kg) + SWF (27 g/kg), or madopa (30 mg/kg) + SWF (18 g/kg) for 22 days.Observed the incidence of LID and assessed the abnormal involuntary movement(AIM)scores in every group.Detected the dynamic change of hydroxyl free radicals indexes (concentration of 2,3-DHBA and 2,5-DHBA), captured by salicylic acid in the extracellular fluid of target tissue in free moving LID rats by brain microdialysis and HPLC-ED techniques; evaluated the changes of superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) level in blood after microdialysis.ResultsSWF reduced the incidence of LID and AIM scores significantly, decreased the concentration of 2,3-DHBA and 2,5-DHBA in extracellular fluids of striatum; meanwhile significantly decreased the MDA level in the serum. ConclusionSWF can improve the behavior and had the effect of prevention and protection on LID rats.Its mechanism is connected with reduction of oxidative stress damages in organism and especially in the target organs.

levodopa-induced dyskinesia(LID);oxidative stress;ShouwuFang (SWF); microdialysis

國家自然科學基金(81274121)；中國中醫科學院自主選題研究項目(ZZ2012010)

焦玥，女，博士在讀，研究方向：中藥藥理學，E-mail:jiaoyue_medicine@163.com；王丹巧，通訊作者，女，博士，研究員，博士生導師，研究方向：中藥藥理、中西醫結合老年醫學基礎研究，E-mail：dq_wang96@sohu.com; 梁嶸，共同通訊作者，女，博士，教授，博士生導師，研究方向：中醫診法的客觀化與規范化研究，E-mail：liangr@hotmail.com。

R332

A

1005-1678(2015)02-0001-05