N-乙酰半胱氨酸對心衰兔氧化應激和核因子NF-κB的干預研究

李燕,萬汝根

(1.南陽市中心醫院 心內二科，河南 南陽 473000；2.東陽市人民醫院 心內科，浙江 東陽 322103)

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N-乙酰半胱氨酸對心衰兔氧化應激和核因子NF-κB的干預研究

李燕1,萬汝根2

(1.南陽市中心醫院 心內二科，河南 南陽 473000；2.東陽市人民醫院 心內科，浙江 東陽 322103)

目的 探討N-乙酰半胱氨酸對心衰兔氧化應激和核因子NF-κB的干預研究。方法 40 只健康成年大白兔，耳緣注射阿霉素制作心衰模型。8周后取造模成功的27只大白兔隨機分為心衰組(n=14)和N-乙酰半胱氨酸組(NAC組，n=13)，另取10只為對照組。對照組和心衰組給予注射生理鹽水1 mL/(kg·d)，NAC組給予注射NAC 300 mg/(kg·d)。干預4 周后，測定各組兔超聲心動圖參數(LVEDD、LVESD、IVST、EF、FS)、血清及心肌組織總抗氧化能力；酶聯免疫檢測各組兔血清和心肌組織8-iso-PGF2α的含量；免疫組化和Western blot 檢測NF-κB p65及其抑制物IκB-α在左室心肌細胞的表達和核結合活性的改變。結果 與對照組相比，心衰組兔左室舒張期末內徑(LVEDD)、左室收縮期末內徑(LVESD)明顯增大(P<0.05)；射血分數(EF)與短軸縮短率(FS)明顯降低(P<0.05)，室間隔厚度(IVST)未見明顯變薄。心衰組血清和心肌的總抗氧化能力均低于對照組(P<0.01)；與心衰組比較，NAC干預組總抗氧化能力明顯升高(P<0.05)，與對照組比較差異無統計學意義。NAC注射組較心衰組心肌細胞NF-κB p65向核內移位表達的陽性細胞明顯減少，NAC治療后兔心肌細胞NF-κB p65的表達較心衰組減少(P<0.05)，IκB-α表達較心衰組多(P<0.05)。心衰后給予NAC干預的兔血清和心肌組織8-iso-PGF2α含量較心衰組顯著降低(P<0.05)，血清和心肌8-iso-PGF2α的含量均與心功能顯著相關(r=0.975,P<0.005;r=0.974,P<0.05)。結論 氧化應激參與了心力衰竭的發生和心功能的惡化；NAC 可通過抑制氧化應激，拮抗NF-κB的活化和其在核內的表達，減少心肌細胞凋亡及炎癥反應，有效改善心功能，保護心肌。

心力衰竭；NF-κB；細胞凋亡；氧化應激；N-乙酰半胱氨酸

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是一種巰基化合物抗氧化劑，為谷胱甘肽的前體，能增加細胞內谷胱甘肽的含量，穩定細胞膜，保護細胞活性，還可直接清除活性氧， 已經證實它能對抗缺血再灌注等病理狀態下因活性氧所引起的細胞凋亡[1]。NAC具有強大的抗氧化活性，同時也是一種NF-κB的抑制劑，目前作為心、腦缺血再灌注損傷的保護劑被人們重新認識。它在減輕缺血再灌注損傷的同時對心力衰竭是否有影響，其對心衰中NF-κB是否影響心肌細胞的凋亡，心力衰竭的發生發展是否與其復雜的藥理作用機制有關，關于這方面的研究甚少。本課題在已公認的阿霉素誘導慢性心衰的兔模型基礎上，觀察兔左室心肌細胞NF-κB的活化、易位和蛋白表達變化與心肌細胞凋亡的關系、凋亡相關因子Bcl-2、Bax、iNOS基因轉錄和表達變化以及心功能改變，同時對照觀察NAC對上述指標的影響，探討氧化應激及核因子NF-κB在心衰中的發生機制，以期闡明NAC發揮心臟保護的具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：50只健康大白兔，雌雄不限，兔齡5～6個月，體質量(2.50±0.35)kg, 購于南京安立默科技發展有限公司，動物合格證號：SYXK(蘇)2002-0017。本實驗遵循《實驗動物保護條例》。

1.1.2 主要試劑和試劑盒：鹽酸阿霉素注射劑(浙江海正藥業股份有限公司，批號050907)，NAC(乙酰半胱氨酸)注射液(杭州民生藥業集團有限公司，批號0510081)，磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，蛋白分子量(Marker Promega 公司)，ECM 顯色試劑(武漢博士德生物工程有限公司)，PVDF 膜(美國NEC)，細胞裂解液(Pierce 公司)。

游離脂肪酸試劑盒、乳酸試劑盒和ATP 酶試劑盒、總抗氧化能力試劑盒(南京建成生物工程研究所)，8-iso-PGF2α定量酶聯免疫檢測試劑盒(純化的鼠抗兔IgG 包被的微孔板、8-iso-PGF2α抗體和Ache 標記的8-iso-PGF2α抗原及其他試劑組成)、鼠抗兔多克隆NF-κB p65、IκB-α 抗體(北京中山生物技術有限公司)，NF-κB、IκB-α兔SP試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，免疫組化SABC試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 心力衰竭動物模型的制備和分組：隨機選取40 只健康大白兔，根據Dorr RT文獻[2]將鹽酸阿霉素用生理鹽水稀釋成1 mg/mL溶液，耳緣靜脈注射，每次按1.0 mg/kg體質量給藥，每周2次，連續8周，制作兔心衰模型。取造模8周后成功的27 只大白兔隨機分為心衰組(n=14)和NAC 干預組(n=13)，NAC組給予NAC注射液300 mg/kg，耳緣靜脈注射，每天1次，共4 周，對照組與心衰組均注射等體積生理鹽水。剩余10只大白兔設為對照組，耳緣靜脈注射生理鹽水1 mL/kg，每周2 次，連續8周。實驗動物單籠喂養，自由飲水。定期稱體質量，以上3組實驗周期為12周，各組動物年齡、體質量差異均無統計學意義。

1.2.2 超聲心動圖檢查：37只大白兔均在12周末進行超聲心動圖檢查。檢查前剪去胸前絨毛并肌肉注射安定2 mg鎮定。切面選擇常規胸骨旁左室長軸切面二維條件下測量左房和左室內徑、左室舒張期末內徑(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)、左室收縮期末內徑(left ventricular end systolic diameter，LVESD)和室間隔厚度(interventricular septal thickness，IVST)，乳頭肌水平短軸切面行M型取樣以計算射血分數(ejection fraction，EF)和短軸縮短率(fraction shortening，FS)、胸骨旁四腔和觀察室壁運動，肺動脈長軸切面測量肺動脈內徑和頻譜。取心尖三腔、四腔或五腔切面測量主動脈和二尖瓣頻譜。

1.2.3 血清及心肌組織總抗氧化能力(TAOC)測定：動物處死前留取2 mL靜脈血，以3500 r/min離心15 min后留取血清，放于低溫冰箱保存(-20 ℃)備用。取液氮凍存的左心室肌稱重后，于冰浴中剪碎，制備成10%的心肌組織勻漿液，將勻漿1000 r/min離心10 min后留取上清液，分別測定血清及心肌組織中TAOC(采用比色法)。

1.2.4 定量酶聯免疫檢測兔血清和心肌8-iso-PGF2α的含量：采用抗原競爭EIA 法(美國Cayman 化學公司)。實驗結束處死動物前留取2 mL靜脈血，4000 r/min離心15 min取上層血清，-80 ℃保存備用。取液氮凍存的左心室肌組織，加入pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(含0.1 mmol的EDTA)，用勻漿器制成組織勻漿液，將勻漿4000 r/min離心15 min后留取上清備用，檢測8-iso-PGF2α。

2 結果

2.1 N-乙酰半胱氨酸對心衰兔氧化應激的干預作用

2.1.1 3組動物超聲心動圖各參數值比較：經胸超聲心動圖結果：與對照組相比，心衰組兔左室舒張期末內徑、左室收縮期末內徑均增大(P<0.05)；射血分數與短軸縮短率降低(P<0.05)，室間隔厚度未見明顯變薄，見表1。NAC組上述各指標較對照組差異無統計學意義。

表1 3組動物超聲心動圖各參數值比較±s)Tab.1 Comparison of each parameter value of echocardiography parameters among three ±s)

#P<0.05，與對照組比，compared with control group；*P<0.05，與心衰組比，compared with heart failure group

2.1.2 血清及心肌組織總抗氧化能力的變化：心衰組血清和心肌的總抗氧化能力均低于對照組(P<0.01)；與心衰組比較，NAC干預組總抗氧化能力明顯升高(P<0.05)，與對照組比較差異無統計學意義。見表2。

表2 3組動物血清及心肌組織TAOC比較±s)Tab.2 Comparison of TAOC in serum and myocardial tissue among three ±s)

#P<0.05，與對照組比，compared with control group；*P<0.01，與心衰組比，compared with heart failure group

2.1.3 血清和心肌8-iso-PGF2α的含量變化：從表3可知，兔心衰后血清和心肌組織8-iso-PGF2α水平明顯高于對照組(P<0.05)，而心衰后給予NAC干預的兔血清和心肌組織8-iso-PGF2α的含量較心衰組顯著降低(P<0.05)，但仍高于正常對照組(P<0.001)。

表3 3動物血清及心肌組織8-iso-PGF2α含量比較Tab.3 Comparison of serum and myocardial tissue 8-iso-PGF2αcontents among three ±s,pg/mg)

#P<0.05，與對照組比，compared with control group；*P<0.05，與心衰組比，compared with heart failure group

2.1.4 8-iso-PGF2α與心功能的相關性：直線相關分析結果顯示：血清和心肌組織的8-iso-PGF2α水平之間存在著直線關系(F=220.59，P<0.005)，相關系數為0.975，具有顯著意義(P<0.005)。氧化應激指標血清和心肌8-iso-PGF2α與心功能相關分析結果顯示：血清和心肌8-iso-PGF2α水平與心功能指標LVEDP、±dp/dtmax呈顯著直線相關，與其中LVEDP增高程度平行(P<0.01)，與±dp/dtmax均呈顯著負相關(P<0.001)，說明阿霉素誘導心衰兔中的血流動力學惡化與氧化應激有關。見表4。

表4 8-iso-PGF2α與心功能的相關性Tab.4 Correlation of 8-iso-PGF2α and cardiac function

2.2 N-乙酰半胱氨酸對兔心衰中核因子NF-κB的干預作用 NAC對心衰兔心肌細胞NF-κB p65蛋白結合活性的影響：對照組NF-κB p65主要存在于胞質，無明顯核表達。心衰組可見NF-κB p65大量活化，從胞質移位于細胞核內，NF-κB p65蛋白在心肌細胞核內的表達較對照組增多。NAC注射組較心衰組心肌細胞NF-κB p65向核內移位表達的陽性細胞減少。見圖1。

圖1 各組NF-κB p65蛋白免疫組化染色結果(×400)Fig.1 Immunohistochemical staining results of NF-κB p65 protein in each groups (×400)

心肌細胞NF-κB p65和IκB-α蛋白表達的變化： SDS-PAGE凝膠電泳照片,見圖2。心衰組兔左室心肌NF-κB p65蛋白表達高于正常組(P<0.05)，IκB-α蛋白低于正常組(P<0.05)；NAC治療后兔心肌細胞NF-κB p65蛋白表達較心衰組減少(P<0.05)，IκB-α表達較心衰組增多(P<0.05)，但與對照組之間差異無統計學意義。

圖2 3組心肌NF-κB p65和IκB-α蛋白表達比較1，2 ：正常組；3，4：心衰組；5，6：NAC組#P<0.05，與對照組比；*P<0.05，與心衰組比Fig.2 Comparison of myocardial NF-κB p65 and IκB-α protein expression among three groups1,2:control group;3,4: heart failure group;5,6:NAC group#P<0.05, compared with control group;*P<0.05, compared with heart failure group

3 討論

很多種疾病在其病理發展過程中大都伴有超氧自由基的生成，它們能引起脂質過氧化造成組織損傷。近年來，人們已建立了一些反映體內氧自由基的生化指標，如超氧化物歧化酶(SOD)、脂質過氧化物(LPO)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和丙二醛(MDA)等，但它們易受體內外因素的影響，其特異性和敏感性均較低[3-5]。且測定結果不穩定，不能準確反映體內真實水平，臨床意義有限。異構前列腺素(iso-PGF2α)是一種具有生物活性的擬前列腺物質，通過非環氧化酶催化的自由基分解機制，損傷脂質細胞膜花生四烯酸后，經自由基脂質過氧化作用產生的特異性產物，性質穩定，這一代謝途徑不受阿司匹林、吲哚美辛等的影響，只與氧自由基有關，在氧化性水平升高的情況下大量生成，在體液內含量非常穩定。Iso-PGF2α是一組異構體衍生物，其中含量最高的是8-表氧-PGF2α(8-iso-PGF2α)，目前研究的主要成分是8-iso-PGF2。因此8-iso-PGF2α被認為是一種反映氧自由基增加所致的脂質過氧化作用有較高敏感和特異性的生化指標，也是臨床上作為評價抗氧化劑療效的較理想生化指標[6]。

從實驗結果看出，注射阿霉素后兔血清和心肌8-iso-PGF2α的含量增多，總抗氧化能力下降，說明用藥后發生了氧化應激，直線相關分析顯示血清和心肌組織8-iso-PGF2α水平之間存在著直線關系，說明血清8-iso-PGF2α水平可以反映心肌氧化應激的程度。而8-iso-PGF2α與心功能進行相關分析的結果顯示：血清和心肌8-iso-PGF2α水平與心功能指標LVEDP、±dp/dtmax呈顯著直線相關，心功能下降與氧化應激關系密切，隨著氧化應激的加重，心功能受損也越嚴重，最終導致心力衰竭的發生。同時，本實驗對心衰兔進行了為期4周的NAC藥物干預后，觀察到NAC明顯升高了血清及心肌總抗氧化能力，且血清和心肌組織中變化保持一致，降低了心衰兔血清和心肌8-iso-PGF2α的含量，從而降低了體內氧化應激的水平，推測NAC改善心功能的內在機制可能為：直接清除過多的活性氧，抑制體內的氧化應激狀態，提高心肌的抗氧化能力，改善心衰的血流動力學指標，從而改善心功能。本研究結果也顯示在心衰兔心肌中IκB-α蛋白水平降低，并存在NF-κB 持續漸活化增多，表明 NF-κB p65的激活與心肌細胞凋亡有關。NAC不僅是抗氧化劑，還是半胱氨酸和谷光甘肽的前體，后一個特性使得NAC與其他抗氧化劑區別開來，NAC能提高心肌谷光甘肽的含量40%，抑制TNF-α介導的ROS活性氧簇的產生[7]，消除高劑量TNF-α對鈣瞬變和心電刺激心肌細胞收縮的不良影響。

綜上所述， NAC可通過升高血清及心肌總抗氧化能力，降低心衰兔血清和心肌8-iso-PGF2α的含量和NF-κB p54、IκB-α蛋白表達水平，有效改善心功能，保護心肌。

[1] Anversa P,Nadal GB.Myocyte renewal and ventricular remodelling[J].Nature, 2008, 415:240-243.

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[3] Wang GW,Klein JB,Kang YJ.Metallothionein inhibits doxorubicin induced mitochondrial cytochrome release and caspase-3 activation in cardiomyocytes [J].JPharmacol Exp Ther,2011,298(2):461-468.

[4] Yue TL,Ma XL,Wang XK,et al.Possible involvement of stress activated protein kinase signaling pathway and Fas receptor expression in prevention of ischemia/reperfusion-induced cardiomyocyte apoptosis by carvedilol[J].Circ Res,2008,82(2):166-174.

[5] Zechner D,Caig R,Hanford DS,et al.MKK6 activates myocardial cell NF-κB and inhibits apoptosis in a P38 mitogen-activated protein kinase-dependent manner[J].JBiol Chem,2008,273:8232-8239.

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(編校：王儼儼，吳茜)

Effect of N-acetylcysteine on oxidative stress and NF-κB in heart failure rabbits and its mechanism

LI Yan1,WAN Ru-gen2

(1.Department of Cardiology, Nanyang Central Hospital, Nanyang 473000, China; 2.Department of Cardiology, Dongyang People’s Hospital, Dongyang 322103, China)

ObjectiveTo explore the intervention of N-acetylcysteine on oxidative stress and NF-κB in heart failure rabbit and its mechanism.Methods40 healthy mature rabbits with heart failure caused by adriamycin administration through ear venous were modeled.27 rabbits were survival after modeling 8 weeks, and randomly divided into heart failure group (n=14) and N-acetylcysteine group (NAC,n=13).10 another healthy rabbits were chosen as control group.The heart failure group and control group were administrated with saline 1 mL/ (kg·d)and NAC group with NAC 300 mg/ (kg·d).After four weeks, echocardiography parameters (LVEDD，LVESD，IVST，EF and FS), total antioxidant capacity in serum and cardiac muscle tissue of each group were measured.The content of 8-iso-PGF2αin serum and myocardial tissue were detected by ELISA.The change of NF-κB p65 and its inhibitor IκB-α protein expression and nuclear binding activity in the left ventricular myocardial cell were detected by immunohistochemical method and Western blot.ResultsCompared with control group, the left ventricular end diastolic diameter and left ventricular end systolic diameter in heart failure group increased (P<0.05), the ejection fraction and fractional shortening decreased (P<0.05), but interventricular septal thickness was not showing significantly thinner.Total antioxidant capacity in serum and myocardium of heart failure group were lower than those of control group (P<0.01), Compared with heart failure group, the total antioxidant capacity increased in NAC group (P<0.05), and the total antioxidant capacity in control group and NAC group had no statistical difference.The numbers of positive myocardial cells of NF-κB p65 nuclear translocation in NAC group significantly reduced than those in heart failure group NF-κB p65 expression in myocardium of NAC group was lower than heart failure group(P<0.05),and IκB-α expression was higher than heart failure group(P<0.05).The content of 8-iso-PGF2αin serum myocardium of NAC group was significantly lower than that of heart failure group, respectively(P<0.05).The content of 8-iso-PGF2αin serum and myocardium was associated with cardiac function(r=0.975,P<0.005;r=0.974,P<0.05). ConclusionThe oxidative stress is involved in the occurrence and deterioration of cardiac function in heart failure.NAC has strong antioxidant activity, which could inhibit the activation and nuclear expression of NF-κB, reduce apoptosis and myocardial inflammation reaction, and improve cardiac function with myocardial protection.

heart failure; nuclear factor-κB; apoptosis; oxidative stress; N-acetylcystein

浙江省衛生廳(2011KYB151)

李燕，女，碩士，主治醫師，研究方向：冠心病介入治療，E-maili：ly12114@163.com。

R96

A

1005-1678(2015)02-0055-04