熱性驚厥敏感鼠與耐受鼠的建立及海馬差異表達(dá)基因的篩選研究

韋睿,張瑋Δ,于恩彥

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 急診科，云南 昆明 650031；2.浙江省人民醫(yī)院 精神科，浙江 杭州 310014)

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熱性驚厥敏感鼠與耐受鼠的建立及海馬差異表達(dá)基因的篩選研究

韋睿1,張瑋1Δ,于恩彥2

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 急診科，云南 昆明 650031；2.浙江省人民醫(yī)院 精神科，浙江 杭州 310014)

目的 建立熱性驚厥(febrile seizures，F(xiàn)S)大鼠模型，篩選易感基因并探討其相關(guān)的機(jī)制。方法 選取50只SPF級(jí)雄性SD 大鼠21日齡，通過(guò)發(fā)病率分析篩選熱性驚厥敏感鼠與耐受鼠；通過(guò)FS 敏感組和耐受組差異(gene ontology，GO)功能分析，差異Pathway 分析，差異表達(dá)基因間相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)分析，差異表達(dá)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，實(shí)時(shí)定量PCR 驗(yàn)證基因芯片數(shù)據(jù)方法研究其機(jī)制。結(jié)果 篩選獲得FS敏感鼠和FS耐受鼠2種不同表型的FS模型鼠；熱水浴誘導(dǎo)驚厥和KA誘導(dǎo)癲癇實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FS敏感鼠比耐受鼠表現(xiàn)出更強(qiáng)的驚厥發(fā)作現(xiàn)象；2種不同表型的FS模型鼠的表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)分析獲得了1140個(gè)差異表達(dá)基因，其中包括602個(gè)上調(diào)基因，538個(gè)下調(diào)基因，并獲得了差異顯著的GO功能分類；差異表達(dá)基因間相互作用網(wǎng)絡(luò)分析與白介素-6(interlukin-b,IL-6)IL-6有著緊密的聯(lián)系；差異表達(dá)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析得到共有174 個(gè)共表達(dá)能力發(fā)生巨大變化的基因。 同時(shí)，實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證結(jié)果與基因芯片表達(dá)一致，表明基因芯片數(shù)據(jù)的可靠性。結(jié)論 2種不同表型FS 模型鼠的建立提示表觀遺傳機(jī)制可能參與FS 疾病的發(fā)生發(fā)展；大鼠海馬全基因組表達(dá)譜芯片分析結(jié)果提示免疫炎癥、離子通道、代謝等多種因素可能在FS 發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

熱性驚厥；基因芯片；差異表達(dá)基因

熱性驚厥(febrile seizures，F(xiàn)S)，是一種發(fā)生在嬰幼兒和兒童時(shí)期常見(jiàn)的、伴有體溫升高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常癲癇綜合征，通常與發(fā)熱有關(guān)，但沒(méi)有明顯的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染[1-3]。有關(guān)研究顯示，F(xiàn)S的發(fā)病率在歐美國(guó)家為2%～5%，中國(guó)為5%～6%，日本為6%～9%，西太平洋馬利亞群島則為11.4%，并且表現(xiàn)出明顯的種族和地域的差異性，具有典型特征的促發(fā)因素(高熱)和發(fā)作年齡范圍(6月～6歲)[4-5]。流行病學(xué)調(diào)查顯示復(fù)雜型FS患者發(fā)生癲癇的相對(duì)危險(xiǎn)性是一般兒童的10倍，嚴(yán)重影響廣大兒童患者的身心健康和智力發(fā)育[6-7]。盡管多數(shù)FS是自限性的，但少部分病人后來(lái)演變?yōu)榉菬狍@厥。復(fù)雜型FS被認(rèn)為能夠?qū)е潞ｑR及顳葉硬化，它們是導(dǎo)致癲癇發(fā)生的病理基礎(chǔ)。目前，關(guān)于FS疾病的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚。本研究旨在通過(guò)建立新的FS動(dòng)物模型，采用高通量基因組學(xué)技術(shù)，篩選新的FS遺傳易感基因，對(duì)于闡釋FS的發(fā)病機(jī)制及其內(nèi)在聯(lián)系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：50只SPF級(jí)雄性SD大鼠(21日齡)，體質(zhì)量為50～54 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)：2013A032)。動(dòng)物飼養(yǎng)室溫20 ℃，相對(duì)濕度60%，每日光照12 h，自由攝食、飲水。定期打掃衛(wèi)生，保持環(huán)境整潔，并注意避免非特異性應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。動(dòng)物使用和處理遵照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生署頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)護(hù)和使用指南》。

1.1.2 主要試劑和儀器：水合氯醛、青霉素、KA均購(gòu)自南京建成，DNA提取試劑盒購(gòu)自Santa Cruz。

恒溫的水浴箱、高恒溫水浴箱(Selby Scientific and Medical，美國(guó))；紫外凝膠成像儀(Vilber Lourmat 公司，法國(guó))；電泳儀(北京東方儀器廠)；電子天平(METTER TOLEDO 公司，型號(hào)：PL203)；不銹鋼滅菌鍋(上海申安醫(yī)療設(shè)備，型號(hào)DSX-280A)。

1.2 方法

1.2.1 熱性驚厥敏感鼠與耐受鼠的建立：FS動(dòng)物模型的篩選方法：第一代選取50只21日齡雌雄各半野生型SD大鼠，根據(jù)經(jīng)典的熱水浴誘導(dǎo)驚厥模型的方法[8]，將大鼠放入一個(gè)透明的玻璃筒中(直徑6 cm，高20 cm)，此玻璃筒下部有多個(gè)小孔與外部相通。將筒豎立于恒溫(45.00±0.25) ℃的水浴箱中，通過(guò)向玻璃筒底墊放塑料墊片以調(diào)節(jié)筒中水的深度，以大鼠沿筒壁站立時(shí)僅能露出頭部為準(zhǔn)，水浴4 min；對(duì)熱水浴處理的大鼠進(jìn)行攝像，雙盲法記錄大鼠發(fā)作的潛伏期、持續(xù)時(shí)間、發(fā)作等級(jí)。驚厥潛伏期(min)：水浴開(kāi)始至開(kāi)始發(fā)生驚厥之間的時(shí)間。驚厥持續(xù)時(shí)間(min)：開(kāi)始發(fā)生驚厥至驚厥停止之間的時(shí)間。按照FS的5級(jí)行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[9]：0級(jí)為未發(fā)生驚厥；1級(jí)為面部抽動(dòng)；2級(jí)為點(diǎn)頭、甩尾；3級(jí)為一側(cè)前肢抬起陣攣；4級(jí)為全身強(qiáng)直，雙側(cè)前肢抬起、痙攣；5級(jí)為全身強(qiáng)直陣攣，跌倒。篩選出FS最敏感鼠和最耐受鼠并模擬人類遺傳方式進(jìn)行交配繁殖下一代。按照同樣的篩選流程獲得第二代FS最敏感鼠和最耐受鼠，以此類推。除了記錄動(dòng)物行為學(xué)指標(biāo)外，還通過(guò)檢測(cè)熱水浴誘導(dǎo)之后大鼠腦電圖指標(biāo)變化情況進(jìn)一步確定該模型篩選方法的正確性及可靠性。

FS大鼠腦電圖記錄方法：選取21日齡FS敏感大鼠和耐受大鼠各6只，以水合氯醛腹腔麻醉(劑量為350 mg/kg)，俯臥位固定，使頭頂部保持水平，剪開(kāi)頭頂部皮膚，分離皮下組織，剝離刮掉骨膜，暴露顱骨；分別在顱骨相應(yīng)位置用小型電鉆鉆一小孔。海馬電極坐標(biāo)，前囟后7.5 mm，中線左右旁開(kāi)2.5 mm，硬腦膜下深度2.5 mm；將高壓消毒后電極短端植入小孔，用調(diào)好的玻璃離子體水門汀把電極固定于顱骨。全部操作過(guò)程無(wú)菌操作，術(shù)后每只小鼠肌注青霉素2000 U/d，連續(xù)3 d。電極埋置7 d后，大鼠行為狀態(tài)未見(jiàn)異常。準(zhǔn)備進(jìn)行海馬腦電圖的記錄。首先將電極導(dǎo)線端與信號(hào)采集系統(tǒng)連接，線路連通后運(yùn)行軟件，設(shè)置腦電圖記錄參數(shù)(紙速3 cm/s，敏感度50 μV/5mm)，待穩(wěn)定后監(jiān)測(cè)腦電圖。水浴前5 min，記錄FS敏感組鼠大和耐受組大鼠正常情況下的基礎(chǔ)腦電，待基礎(chǔ)腦電穩(wěn)定后，將FS敏感組鼠大和耐受組大鼠放入45 ℃水浴中4 min，記錄2組模型鼠腦電圖的變化，并由另外一名人員記錄2組模型鼠的行為學(xué)的變化。

KA誘導(dǎo)大鼠癲癇模型：選取第二代21日齡FS敏感組雄性大鼠和耐受組雄性大鼠各5只，腹腔注射KA(3 mg/mL)，按照FS的5級(jí)行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行等級(jí)評(píng)分。

1.2.2 熱性驚厥敏感鼠與耐受鼠海馬全基因組表達(dá)譜芯片分析：FS敏感組和耐受組差異(gene ontology，GO)功能分析：對(duì)于上述篩選的差異表達(dá)基因，通過(guò)NCBI、Swissprot/Uniprot、AmiGO等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的信息對(duì)其進(jìn)行GO功能注釋分析，通過(guò)計(jì)算富集倍數(shù)(enrichment fold)和P值(Fisher檢驗(yàn))，可以鑒定出該基因群中顯著富集的GO功能類別。

FS敏感組和耐受組差異Pathway分析：通過(guò)整合KEGG、Biocarta、Reactome等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)信息，利用超幾何分布的Fisher精確檢驗(yàn)的方法對(duì)差異表達(dá)基因所參與的Pathway進(jìn)行顯著性分析。

差異表達(dá)基因間相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)分析：通過(guò)整合Pubmed textmining、同源預(yù)測(cè)、基因neighbor、蛋白-蛋白相互作用、基因融合等數(shù)據(jù)，建立一個(gè)包含所有差異表達(dá)基因的單節(jié)點(diǎn)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

差異表達(dá)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析：通過(guò)基因芯片模擬生物信息學(xué)軟件構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，基因在芯片上的表達(dá)信號(hào)強(qiáng)度的變化反映了基因間的內(nèi)在聯(lián)系及動(dòng)力學(xué)過(guò)程。根據(jù)基因芯片實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)的相關(guān)性，預(yù)測(cè)基因間存在的共表達(dá)關(guān)系，以此構(gòu)建基因間的共表達(dá)作用網(wǎng)絡(luò)。然后根據(jù)圖論原理計(jì)算出每個(gè)基因在網(wǎng)絡(luò)中的共表達(dá)能力。

實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證基因芯片數(shù)據(jù)：為了驗(yàn)證大鼠全基因組表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)的可靠性，選取10個(gè)差異表達(dá)基因，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR的方法進(jìn)行驗(yàn)證。首先，提取海馬組織樣本的總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板。根據(jù)每個(gè)基因的cDNA序列設(shè)計(jì)特異的熒光定量PCR引物初步檢物初步檢測(cè)各個(gè)基因的表達(dá)情況；按照天根熒光定量試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作方法操作[10]。

國(guó)有企業(yè)改革要以完善的財(cái)務(wù)管理預(yù)算體系為基礎(chǔ)，通過(guò)在經(jīng)營(yíng)管理過(guò)程總有效的編制財(cái)務(wù)預(yù)算，從而促進(jìn)建立、健全各種財(cái)務(wù)規(guī)章制度。預(yù)算管理要充分發(fā)揮國(guó)有企業(yè)管理層次的引導(dǎo)作用，以管理者為突破口，強(qiáng)化其財(cái)務(wù)預(yù)算管理的意識(shí)，來(lái)調(diào)動(dòng)管理層進(jìn)行有效財(cái)務(wù)預(yù)算觀的積極性，將預(yù)算管理能夠切實(shí)的落到實(shí)處。除此之蛙，要做好國(guó)有企業(yè)員工的思想教育工作，采取各種措施進(jìn)行財(cái)務(wù)預(yù)算管理培訓(xùn)，以此來(lái)增強(qiáng)全員對(duì)財(cái)務(wù)管理預(yù)算的認(rèn)識(shí)。

2 結(jié)果

2.1 熱性驚厥敏感鼠與耐受鼠的建立

2.1.1 FS動(dòng)物模型的篩選：對(duì)有癲癇發(fā)作或者耐受41.0 ℃大鼠進(jìn)行雜交，尋找F1子代中有癲癇發(fā)作的后代，進(jìn)行純化，尋找F2代中的純合子，將F2代的純合子進(jìn)行純化，以此類推尋找F3、F4代。2組不同表型FS模型大鼠家系圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 2組不同表型FS家系大鼠圖譜Fig.1 Atlas of FS family rats in 2 different phenotypes

FS模型鼠發(fā)病率分析：通過(guò)分析2組FS發(fā)病率，從F0～F4代，經(jīng)過(guò)熱水浴誘導(dǎo)，當(dāng)大鼠核心體溫到達(dá)41 ℃時(shí)，F(xiàn)S敏感鼠的發(fā)病率從25%升高至71.4%。而在核心體溫為43 ℃時(shí)，F(xiàn)S耐受鼠發(fā)病率從62.5%逐漸降低至28.6%。結(jié)果顯示，通過(guò)人工定向篩選，F(xiàn)S敏感鼠和耐受鼠的表型逐漸的分離開(kāi)來(lái)，具有不同的溫度敏感性。見(jiàn)圖2。

圖2 五代(F0～F4)FS敏感鼠與耐受鼠發(fā)病率分析Fig.2 Sensitivity analysis of the incidence of FS and tolerance in rats of five generation(F0～F4)

2.1.2 熱水浴誘導(dǎo)后FS敏感組與耐受組大鼠腦電圖分析：對(duì)2組模型鼠腦電圖結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)S敏感鼠的腦電與耐受鼠腦電相比，表現(xiàn)出高幅度和高頻率。FS敏感鼠(圖3A上)和耐受鼠(圖3A下)水浴后腦電發(fā)作經(jīng)放大后(圖3B上，圖3B下)發(fā)現(xiàn)2組都呈現(xiàn)尖波發(fā)作。經(jīng)過(guò)腦電圖功率圖譜的統(tǒng)計(jì)分析，F(xiàn)S敏感組大鼠腦電功率與FS耐受組大鼠腦電功率差異顯著(P<0.001)見(jiàn)圖3C。同時(shí)EEG結(jié)果顯示FS敏感組比耐受組表現(xiàn)出嚴(yán)重的驚厥行為。因此，圖3結(jié)果可推斷出FS敏感組比耐受組具有更強(qiáng)的高熱敏感性。

P<0.05，與耐受鼠相比，compared with tolerant rats圖3 45 ℃熱水浴誘導(dǎo)后FS敏感鼠與耐受鼠腦電圖分析Fig.3 EEG analysis of FS sensitive rats and tolerant rats after induced by 45 ℃ hot water bath

2.1.3 KA誘導(dǎo)后FS敏感組與耐受組大鼠腦電圖分析：觀察腦電圖可以看出，敏感鼠和耐受鼠腦電圖在大部分頻率波段范圍內(nèi)，KA誘導(dǎo)后發(fā)生改變，敏感鼠的腦電圖變化幅度較大，見(jiàn)圖4A。圖4B表明FS敏感組大鼠的平均腦電功率明顯高于耐受鼠。FS敏感組大鼠的發(fā)作潛伏期顯著低于耐受組大鼠的發(fā)作潛伏期(P<0.05)，見(jiàn)圖4C。記錄驚厥等級(jí)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)S敏感組大鼠的發(fā)作等級(jí)最高，100%的大鼠出現(xiàn)了5級(jí)驚厥行為，而耐受組大鼠僅有20%出現(xiàn)了3級(jí)以上的驚厥行為(圖4D)，2組模型鼠相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示，與FS耐受組大鼠相比，F(xiàn)S敏感組大鼠對(duì)KA誘導(dǎo)癲癇的發(fā)生更加敏感。

圖4 KA誘導(dǎo)后FS敏感鼠與耐受鼠腦電圖分析*P<0.05，與耐受鼠相比Fig.4 EEG analysis of FS sensitive rats and tolerant rats after induced by KA*P<0.05，compared with tolerant rats

2.2 熱性驚厥敏感鼠與耐受鼠海馬全基因組表達(dá)譜芯片分析

圖5 差異GO功能分析Fig.5 Analysis of difference between GO function

2.2.2 差異表達(dá)基因間相互作用網(wǎng)絡(luò)分析：IL-6作為一個(gè)重要的FS易感基因位于基因網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖的中心，它可能在FS疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到更加重要的作用。其他的差異表達(dá)基因(如APOA5，S100A8，KCNMA1，DPP4)與IL-6有著直接或間接的聯(lián)系。按照同樣的方法，本研究將篩選的免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因構(gòu)建基因間分子網(wǎng)絡(luò)，在免疫相關(guān)基因的分子網(wǎng)絡(luò)中，IL-6也位于分子網(wǎng)絡(luò)的中心，其他的免疫相關(guān)基因(如S100A9，DPP4，STAT5A)與IL-6有著緊密的聯(lián)系。這些分子網(wǎng)絡(luò)中的差異表達(dá)基因可能在FS疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推斷出FS與免疫炎癥因素存在緊密相互關(guān)系。見(jiàn)圖6。

圖6 差異表達(dá)基因間相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 The interactions between network map of differentially expressed genes

2.2.3 差異表達(dá)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析：通過(guò)比較FS敏感組和FS耐受組網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及基因的共表達(dá)能力，最終得到共有174個(gè)共表達(dá)能力發(fā)生巨大變化的基因。在共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中，通過(guò)K值來(lái)表示基因功能的相似性，K值越高代表這個(gè)基因可能起到的作用越大。通過(guò)分析K值發(fā)現(xiàn)共有38個(gè)差異表達(dá)基因可能在FS疾病的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵的作用，其中包括溶質(zhì)轉(zhuǎn)體家族(Slc18A2，SLC6A4)，離子通道家族(Scn5a，Kcnma1，Kcnq4)，嗅覺(jué)受體(Olr1253，Olr1679，Olr536)等。以上結(jié)果分析顯示，這些共表達(dá)基因可能在FS疾病的發(fā)生發(fā)展中起到非常重要的作用。見(jiàn)表1。

表1 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果Tab.1 Analysis results of co-expression network

2.2.4 基因芯片可靠性驗(yàn)證：為了進(jìn)一步證實(shí)基因芯片的質(zhì)量及芯片數(shù)據(jù)的可靠性，本文在1140個(gè)差異表達(dá)基因中，選取了10個(gè)差異表達(dá)基因(5個(gè)上調(diào)基因，5個(gè)下調(diào)基因)(圖7A)利用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，定量PCR的驗(yàn)證結(jié)果(圖7B)與基因芯片的結(jié)果相符，證明基因芯片這種方便快捷，高通量，大規(guī)模的基因表達(dá)研究技術(shù)是值得信賴的。見(jiàn)圖7。

圖7 差異表達(dá)基因的驗(yàn)證Fig.7 Identity of differentially expressed genes

3 討論

本文通過(guò)經(jīng)典熱水浴誘導(dǎo)驚厥并結(jié)合人工定向選擇篩選的方式成功獲得了2種不同表型的FS模型鼠。這2種模型鼠的建立為后期尋找新的FS易感基因進(jìn)而闡明FS的發(fā)病機(jī)制提供了良好的基礎(chǔ)。本文對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了深入的信息挖掘分析，獲得了與FS相關(guān)的差異性GO。上調(diào)差異表達(dá)基因所參與的差異GO主要與干擾素、IL-6、IL-3的細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)，下調(diào)差異表達(dá)基因所參與的GO主要與T細(xì)胞的增殖和免疫系統(tǒng)進(jìn)程相關(guān)。這些免疫相關(guān)GO功能信息提示FS與免疫炎癥之間存在著密切的關(guān)系，對(duì)于研究免疫炎癥在FS中的作用提供了重要線索。最新研究表明，免疫和炎癥進(jìn)程在FS中作用非常重要[11]，特別是由于感染、神經(jīng)創(chuàng)傷等與癲癇相關(guān)的因素引起的先天免疫機(jī)制和隨后的炎癥反應(yīng)。一些相關(guān)的炎癥信號(hào)通路被證明與FS的發(fā)生有關(guān)，例如Toll樣受體信號(hào)通路、NF-κB，MAPK信號(hào)通路。在上調(diào)差異pathway中存在類固醇激素的生物合成通路，類固醇激素主要包括糖皮質(zhì)激素、皮質(zhì)酮、孕激素等，類固醇激素可以作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的信息傳遞物質(zhì)，與神經(jīng)細(xì)胞的興奮性和突觸可塑性有著密切的關(guān)系。同時(shí)，該通路與表觀遺傳效應(yīng)存在密切關(guān)系，這些激素可以通過(guò)與其各自受體相互作用影響基因的表觀遺傳修飾，例如組蛋白甲基化、乙?；M(jìn)而可以影響動(dòng)物的行為表現(xiàn)[12]。這些信息提示表觀遺傳機(jī)制可能會(huì)影響FS的發(fā)生發(fā)展。此外，在差異表達(dá)基因及差異pathway中，發(fā)現(xiàn)一些代謝相關(guān)的基因和信號(hào)通路。例如，APOA5、APOC3、PPAR信號(hào)通路、細(xì)胞色素CYP450代謝通路、花生四烯酸代謝通路等，提示FS可能與代謝相關(guān)基因及其信號(hào)通路存在緊密的聯(lián)系。

另外，本文從1140個(gè)差異表達(dá)基因中選取免疫相關(guān)差異表達(dá)基因，利用相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)信息構(gòu)建了差異表達(dá)基因間相互作用關(guān)系圖。在基因相互作用關(guān)系圖中，發(fā)現(xiàn)IL-6位于基因網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖中心位置，提示它可能起到關(guān)鍵作用。盡管IL-6在正常的大腦中出于低表達(dá)水平，但是驚厥誘導(dǎo)后其基因表達(dá)水平迅速升高[13]。IL-6過(guò)表達(dá)可以通過(guò)削弱海馬中GABA神經(jīng)元的抑制作用進(jìn)而增加驚厥敏感程度[14]。另外1個(gè)免疫相關(guān)基因-DPP4(又稱CD26)，在基因網(wǎng)絡(luò)圖中與IL-6有直接的聯(lián)系，提示2個(gè)基因間的相互作用可能會(huì)影響FS的發(fā)生發(fā)展。DPP4是一種T細(xì)胞表面抗原，同時(shí)它作為一種二肽基肽酶可以水解多種不同的底物，包括胃腸激素(GLP-1)、神經(jīng)肽類(NPY)、趨化因子類(CCL3，CXCL10)等[15]。先前的研究表明，GLP-1可以通過(guò)GLP-1R受體信號(hào)通路減弱驚厥發(fā)作。將小鼠的GLP-R受體敲除后中發(fā)現(xiàn)可以增加驚厥的嚴(yán)重程度和神經(jīng)元的興奮性。DPP4的另外一種底物-神經(jīng)肽Y，可以通過(guò)其受體抑制驚厥的發(fā)生。DPP4抑制劑也可以減弱由于糖尿病引起的IL-6和IL-1β的表達(dá)升高。在FS敏感組中，差異表達(dá)基因IL-6和DPP4基因表達(dá)上調(diào)，結(jié)果顯示免疫炎癥可能在FS中起到重要的作用。

綜上所述，通過(guò)對(duì)大鼠海馬表達(dá)譜基因芯片的分析，獲得了一些候選易感基因和重要的差異GO功能、差異信號(hào)通路、差異基因間的相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系及共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，為闡明FS發(fā)病機(jī)制提供很好的線索。

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(編校：王冬梅)

Construction of febrile seizures sensitive,tolerance rats and screening of differential expression genes of febrile seizures hippocampus

WEI Rui1, ZHANG Wei1Δ,YU En-yan2

(1.Department of Emergency, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650031, China; 2.Department of Psychiatry, People’s Hospital of Zhejiang Province, Hangzhou 310014, China)

ObjectiveTo establish the animal model of febrile seizures(FS), screen susceptibility genes and investigate the related pathogenesis.Methods50 SPF male SD rats (aged 21 days) were selected,screened febrile seizure sensitive and tolerant rats by the incidence of FS.Differences in gene ontology (GO) function,pathway,network interaction of genes differential expression,and differential expression of gene co-expression network were analyzed between FS sensitive group and tolerant group.The validation of gene chip data method was analyzed by Real-time PCR.ResultsAccess to two different phenotypes of FS rat model of screening,including FS sensitive rats and FS tolerance rats.After 43 hot water bath treatment,the incidence of FS sensitive rats rate with increasing passage number and gradually increase.Hot water bath induced seizures and KA induced epilepsy experimental results showed that the FS sensitive rats exhibited stronger seizure phenomenon than tolerance rats.Obtained 1140 differentially expressed genes by expression of two different phenotypes of FS rat models in microarray data analysis,including 602 up-regulated and 538 down regulated genes,and obtained the GO functional classification differences.Differentially expressed genes interaction network analysis showed that were closely with IL-6,The co-expression network analysis,there were 174 gene of co-expression ability changed tremendous. At the same time,real time quantitative PCR validation results consistent with gene chip expression,showed that the reliability of microarray data. ConclusionRat model of FS suggested that epigenetic regulation may play an important role in the pathogenesis of FS.Meanwhile,rat hippocampal gene microarray results suggest that many factors (immunity，ion channels，metabolism et.al) may paly a vital role in the pathogenesis of FS.

febrile seizures; microarray; differential expression genes

2011年省醫(yī)藥衛(wèi)生計(jì)劃(2011KYA012)

韋睿，女，本科，主治醫(yī)師，研究方向：急診醫(yī)學(xué)，E-mail:qch1821460080@163.com；張瑋，通訊作者，男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：重癥醫(yī)學(xué)，E-mail:qch1821460081@163.com。

R363

A

1005-1678(2015)02-0074-06