異甘草酸鎂對奧沙利鉑在人胃癌裸鼠模型中抗腫瘤作用的影響研究

郭曼，趙園園，何信佳，于麗，張蕊，葉寶玲

(青島大學附屬醫院，1.腫瘤科;2.檢驗科，山東 青島 266000)

胃癌是中國最常見的消化道惡性腫瘤，多數患者發現時已屬中晚期，僅通過手術難以治愈［1］?；熥鳛橹匾闹委熓侄?，往往引起的肝功能損害，嚴重的藥物性肝損傷使得患者不能按期完成化療或不能承受應用劑量，從而影響治療效果［2］。異甘草酸鎂(magnesium isoglycyrrhizinate，MgIG)是一種臨床常用的保肝藥物，在治療化療藥物性肝損害時具有肝功恢復快、不良反應少的優點［3－4］。本研究建立人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型，通過MgIG結合奧沙利鉑(oxaliplatin，L-OHP)對動物模型的干預，探討MgIG對L-OHP抗腫瘤作用的影響，為MgIG在臨床中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞株和動物

人胃癌細胞株SGC-7901由青島大學醫學院實驗中心惠贈。BALB/c雄性裸小鼠60只，周齡5～6周，體質量18～23 g，購自購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于中國海洋大學醫藥學院分子藥理實驗室。

1.2 藥品與試劑

MgIG注射液(國藥準字H20051942)購自江蘇正大天晴藥業股份有限公司;L-OHP(國藥準字H20000337)購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司;DMEM培養液購自美國Sigma公司。

1.3 細胞的培養和人胃癌裸鼠模型的建立

人胃癌細胞株SGC-7901在DMEM培養液(含體積分數 0.1滅活胎牛血清、10 U/L青霉素、10 U/L鏈霉素)，在37℃下于體積分數0.05的CO2培養箱中培養。將處于數生長期細胞運用胰酶消化，用PBS液稀釋，制備成細胞密度為4×1010/L的單細胞懸液。在超凈工作臺內于裸鼠右腋下皮下注射0.2 mL細胞懸液，10 d后所有裸鼠右腋下均出現長徑約5～8 mm的皮下結節，提示移植瘤模型建立成功。

1.4 分組與處理

將60只人胃癌裸鼠移植瘤模型隨機分為6組，每組 10只:高(40 mg/kg)、中(20 mg/kg)、低(10 mg/kg)劑量MgIG聯合L-OHP組(6 mg/kg)、單純L-OHP(6 mg/kg)組、單純MgIG(20 mg/kg)和葡萄糖對照組(5%葡萄糖注射液0.2 mL)。L-OHP每3 d給藥1次，MgIG和葡萄糖均為1次/d給藥。L-OHP和MgIG均用5%葡萄糖溶液稀釋，給藥途徑均為尾靜脈注射給藥，0.2 mL/只，連續用藥14 d。

1.5 檢測指標

自首次給藥起，連續監測裸鼠一般情況，每2 d用游標卡尺測量移植瘤大小一次，記錄長徑(a)和短徑(b)，腫瘤體積=(ab2)/2［5］。并測定裸鼠體質量。停藥后第2天用摘眼球取血法采集血樣，用于檢測裸鼠肝功能，主要包括丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(AST)。處死裸鼠后剝離腫瘤組織，稱取瘤質量，計算質量抑瘤率，抑瘤率(瘤質量)=(對照組平均瘤質量－實驗組平均瘤質量)/對照組平均瘤質量×100%;測量移植瘤體積，計算體積抑瘤率，抑瘤率(瘤體積)=(對照組平均瘤體積－實驗組平均瘤體積)/對照組平均瘤體積×100%。TUNEL法檢測移植瘤細胞凋亡率，操作方法嚴格按照試劑盒說明，每張切片隨機選取10個視野在400倍鏡下計數，計算凋亡細胞百分比及其標準差，陽性細胞率=陽性細胞數/總細胞數×100%。裸鼠腫瘤組織于－70℃冰箱保存備檢。

1.6 統計學分析

采用SPSS19.0統計軟件，計量資料以均數±標準差(x－±s)表示，兩組間均數比較采用配對t檢驗，組間差異采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 裸鼠一般情況

各組裸鼠均于接種10 d后成瘤明顯，成瘤率及移植瘤大小無明顯差異，對各組移植瘤大小進行方差齊性檢驗示方差齊(P=0.376)，方差分析顯示各組間差異無統計學意義(F=0.801，P ＞0.05)。見表1。

給藥期間，各組裸鼠均未出現死亡，移植瘤未出現破潰，不同劑量MgIG聯合L-OHP組裸鼠出現不同程度的消瘦，精神狀態稍差，進食、飲水尚可，大小便正常;單純L-OHP組裸鼠消瘦明顯，進食量最少，精神萎靡，出現不同程度腹瀉。單純MgIG和葡萄糖對照組裸鼠精神狀態好、進食正常，大小便正常，較活躍。處死裸鼠并解剖，各組均未見腹水及其他部位轉移病灶。與用藥前比較，高、中、低劑量MgIG聯合L-OHP組和單純L-OHP組裸鼠用藥后體質量有不同程度的降低，差異有統計學意義。見表2。

表1 接種10 d后各組裸鼠成瘤大小比較(mm3)

表2 用藥前后裸鼠的體質量變化(g±s，n=10)

表2 用藥前后裸鼠的體質量變化(g±s，n=10)

高劑量MgIG聯合L-OHP組24.58 ±1.71 21.74 ±1.58 －2.84 ±0.47 3.89 ＜0.05中劑量MgIG 聯合 L-OHP組 24.81±1.30 22.06±1.34 －2.75±0.89 4.65 ＜0.01低劑量MgIG 聯合 L-OHP組 24.55±1.10 21.77±1.21 －2.79±0.84 5.40 ＜0.01單純 L-OHP 組 25.04 ±0.99 21.56 ±1.04 －3.48 ±0.46 7.67 ＜0.01單純 MgIG 組 24.61 ±1.09 25.31 ±1.09 0.70 ±0.40 1.44 ＞0.05葡萄糖對照組25.03 ±1.20 25.27 ±1.26 0.24 ±0.60 0.44 ＞0.05

2.2 各組裸鼠移植瘤生長曲線

給藥后，各劑量MgIG聯合L-OHP組及單純LOHP組的皮下移植瘤生長速度低于葡萄糖對照組及單純MgGI組。單純MgGI組和葡萄糖對照組移植瘤生長曲線較陡，高、中劑量MgIG聯合L-OHP組生長曲線較緩，低劑量MgIG聯合L-OHP組和單純L-OHP組介于上述兩者之間。見圖1。

圖1 各組裸鼠胃癌移植瘤生長曲線

2.3 各組移植瘤的瘤體積、瘤質量相應抑瘤率比較

移植瘤體積變化方面，與葡萄糖對照組相比，高、中、低劑量MgIG聯合L-OHP組及單純L-OHP組表現出了明顯的抗腫瘤作用，體積抑瘤率分別為46.92%、43.03%、40.08%、35.53%，移植瘤體積減少幅度隨著MgIG劑量的增加而增加(F=611.39，P＜0.05)，提示與L-OHP聯用時，MgIG提高了奧沙利鉑的抗腫瘤作用，并且呈劑量依賴性。此外，與葡萄糖對照組相比，單純MgIG組未表現出明顯的抗腫瘤作用，差異無統計學意義(P＞0.05);高、中、低劑量MgIG聯合L-OHP組與單純L-OHP組相比，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表3和圖2。

移植瘤質量變化方面，與葡萄糖對照組相比，高、中、低劑量MgIG聯合L-OHP組及單純L-OHP組表現出了明顯的抗腫瘤作用，質量抑瘤率分別為44.61%、41.62%、39.21%、35.12%，移植瘤質量減少幅度隨著MgIG劑量的增加而增加(F=337.60，P＜0.05)。此外，與葡萄糖對照組相比，單純MgIG組未表現出明顯的抗腫瘤作用，差異無統計學意義(P＞0.05);高、中、低劑量MgIG聯合 L-OHP組與單純 L-OHP組相比，差異有統計學意義(P＜0.05);組間兩兩比較，高、低劑量MgIG聯合L-OHP組差異有統計學意義(P＜0.05)。見表3和圖2。

表3 各組移植瘤的瘤體積、瘤質量抑瘤率比較(n=10)

圖2 用藥后各組移植瘤的瘤體積、瘤質量抑瘤率比較

2.4 各組裸鼠移植瘤細胞凋亡指數比較

高、中、低劑量 MgIG聯合 L-OHP組，單純 LOHP組，單純MgIG組及葡萄糖對照組的細胞凋亡指數分別為(15.62 ±1.63)%、(15.59 ±2.15)%、(14.57 ± 2.39)%、(13.74 ± 1.89)%、(3.79 ±1.19)%和(3.58±0.92)%。各劑量MgIG聯合LOHP及單純L-OHP組的細胞凋亡指數均高于單純MgIG組及葡萄糖對照組(F=112.04，P ＜0.05);高、中劑量MgIG聯合L-OHP組的凋亡指數高于單純L-OHP組，差異有統計學意義(P＜0.05);低劑量MgIG聯合L-OHP組與單純L-OHP組的凋亡指數差異無統計學意義(P＞0.05);高、中劑量MgIG聯合L-OHP組的凋亡指數差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖3。

圖3 各組裸鼠移植瘤細胞凋亡指數比較

2.5 各組裸鼠肝功能比較

與葡萄糖對照組相比，單純L-OHP組ALT、AST顯著升高，各劑量MgIG聯合L-OHP組均顯著降低，其中以高劑量MgIG聯合L-OHP降低幅度最大。AST水平變化方面，高劑量MgIG聯合L-OHP組、單純MgIG組及葡萄糖對照組差異無統計學意義(P＞0.05);中、低劑量 MgIG聯合 L-OHP組及單純 LOHP組與葡萄糖對照組相比，差異有統計學意義(P＜0.01)。ALT水平變化方面，高劑量MgIG聯合L-OHP組、單純MgIG組及葡萄糖對照組的差異無統計學意義(P＞0.05);中、低劑量 MgIG聯合 LOHP組及單純L-OHP組與葡萄糖對照組相比，差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。見表4。

表4 各組裸鼠肝功能的比較±s，n=10)

表4 各組裸鼠肝功能的比較±s，n=10)

高劑量MgIG聯合L-OHP組138.36 ±22.06 59.83 ±12.74中劑量 MgIG 聯合 L-OHP 組 154.88 ±19.69 70.26 ±10.19低劑量 MgIG 聯合 L-OHP 組 173.19 ±16.45 87.30 ±8.11單純 L-OHP 組 276.23 ±17.82 157.79 ±16.13單純 MgIG 組 135.24 ±17.36 54.91 ±13.58葡萄糖對照組127.50 ±16.16 59.30 ±8.94

3 討論

對于不能手術切除的中晚期胃癌患者，化療是主要的治療措施。然而化療藥物經過肝臟代謝和排泄，可造成不同程度的肝損傷。臨床研究證實，保肝藥物與化療藥物聯用時，可降低肝損傷的發生［6］，然而是否會影響化療藥物的療效目前尚存在爭議。本研究通過建立裸鼠移植瘤模型，觀察L-OHP聯合不同劑量的MgIG對裸鼠移植瘤抑瘤率及凋亡指數的影響，以探討MgIG對L-OHP抗腫瘤作用的影響。通過比較各組裸鼠的肝功能，結果顯示高劑量MgIG聯合L-OHP組、單純MgIG組及葡萄糖對照組ALT和AST水平差異無統計學意義(P＞0.05);與單純L-OHP組相比，不同劑量MgIG聯合L-OHP組ALT和AST水平均較低，差異有統計學意義(P＜0.01)，提示MgIG能一定程度緩解化療藥物L-OHP引起的血清AST升高，具有保護肝功能的作用，與王慧芳等［7］的研究結論基本一致。從腫瘤生長曲線可見，各劑量MgIG聯合L-OHP組的腫瘤生長速度明顯較單純L-OHP組緩慢;同時，各劑量MgIG聯合L-OHP組及單純L-OHP組移植瘤質量和體積顯著低于葡萄糖對照組，隨著MgIG劑量的增加，移植瘤質量和體積縮小程度更加顯著，提示MgIG提高了L-OHP的抑瘤率，與L-OHP聯用具有協同作用。本研究中，各劑量MgIG聯合L-OHP組的移植瘤凋亡指數顯著高于單純L-OHP組，提示MgIG對L-OHP的協同抗腫瘤作用可能與其提高移植瘤的凋亡率有關，但相關機制有待通聯合檢測其他指標進一步研究闡述。

MgIG是第四代甘草酸制劑，是一種肝細胞保護劑，具有抗炎、保護肝細胞膜、清除氧自由基及改善肝功能的作用［8］。MgIG中有效物質甘草酸，由1分子甘草苦質酸和2分子葡萄糖醛酸組成，以18α和18β兩種異構體形式存在，作用于激素受體，影響離子通道的開放，通過激活和抑制酶的活性，調節物質代謝，調節膽堿能神經的興奮性，具有腎上腺皮質激素樣作用，從而呈現抗炎及免疫調節作用［9－10］。研究表明，異甘草酸鎂能抑制肝星狀細胞的增殖和氧化，減輕肝組織炎癥活動度及纖維化程度;降低血清轉氨酶及血漿 NO水平，從而減輕肝組織損害［11－12］，不僅能夠對 D-氨基半乳糖引起大鼠急性肝損傷、四氯化碳引起的慢性肝損傷、Gal/FCA誘發的免疫性肝損害以及對慢性酒精性肝損傷有防治效果，也能夠有效地改善肝切除后及化療藥物引起的肝損傷［13－15］。與以往保肝藥物相比，在治療化療藥物引起的急性肝損傷時，MgIG具有更好的療效和安全性，總有效率可達91.43%，同時可以縮短肝損傷病程，減輕不良反［16］。體外實驗也顯示MgIG與部分化療藥物聯用時，表現出了明顯的協同作用［17］。綜上所述，MgIG在L-OHP對腫瘤的化療中，不僅表現出了明顯的保肝作用，而且潛在增加了L-OHP的抗腫瘤作用，初步體現了協同作用，但機制仍需要進一步研究。

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