豬圓環病毒2型PCR快速檢測方法的建立

于新友　李天芝　王金良　李　峰　沈志強,（山東綠都生物科技有限公司，山東濱州56600；山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東濱州56600）

豬圓環病毒2型PCR快速檢測方法的建立

于新友1李天芝1王金良2李峰2沈志強1,2
（1山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東濱州256600）

摘要：根據GenBank公布的豬圓環病毒2型保守序列設計了一對引物，建立了檢測豬圓環病毒2型PCR方法，并對其特異性、敏感性進行了研究。該PCR方法對豬圓環病毒2型的擴增結果為陽性，而對對照毒株的擴增結果均為陰性；對豬圓環病毒2型檢測的靈敏度為1 pg總DNA量。以上結果表明該PCR方法特異性強、敏感性高、簡便、快速，可用于豬圓環病毒2型的早期確診和病毒鑒定。

關鍵詞：豬圓環病毒2型；PCR方法；快速檢測

豬圓環病毒依據其致病性和基因組差異分為無致病性的豬圓環病毒1型（Porcine Circovirus 1, PCV1）和有致病性的豬圓環病毒2型（Porcine Circovirus 2, PCV2），PCV2是引起仔豬斷奶后多系統衰竭綜合征（post -weaning multisyste wasting syndrome, PMWS）[1]的主要病原，此外，PCV2還與豬皮炎與腎炎綜合征（porcine dermatitis andnephropathy syndrome, PDNS）、豬呼吸道綜合征（porcine respiratory disease complex, PRDC）及繁殖障礙以及腸炎等疾病有關[2]，是一種免疫抑制性疾病，給世界養豬業造成嚴重的經濟損失[3-5]。2000年，我國首次報道了PCV2感染，目前，PCV2感染在我國豬群中廣泛存在，種豬有很高的感染率，與其他疾病混合感染的現象嚴重，臨床上表現為不同的綜合征。

PCV2的傳統檢測方法有病毒分離、酶聯免疫吸附試驗、免疫熒光法和免疫組化法等，這些方法均有很多缺點，如耗時長、檢測敏感性較低及準確性差等，尤其不能檢測亞臨床感染的豬。PCR檢測方法以檢測快速、靈敏度高、特異性好等特點已經廣泛應用于細菌和病毒的檢測，并具有良好的應用前景。為調查山東省PCV2的流行情況，本研究根據GenBank公布的PCV2基因（DQ104423）序列建立了一種特異、敏感的PCV2檢測方法，并用該法對采自山東省各地的PCV2疑似病料進行檢測。

1　材料和方法

1.1病毒株與病料

豬圓環病毒2型（PCV2）、豬圓環病毒1型（PCV1）、豬瘟病毒（CSFV）、豬藍耳病病毒（PRRSV）、豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)及流行性乙型腦炎病毒（JEV）由山東省濱州畜牧獸醫研究院預防獸醫學與動物生物技術重點開放實驗室保存，臨床疑似病料為2013年10月—2014年11月采自山東省各地豬場臨床診斷為PCV2感染豬的脾臟及淋巴結等。

1.2工具酶及試劑盒

pMD18-T載體、限制性內切酶、PCR相關試劑、DNA Marker 和DNA凝膠回收試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司；AxyPrep體液病毒DNA小量試劑盒購自愛思進生物技術(杭州)有限公司。

1.3PCR引物設計與合成

根據GenBank中登錄的PCV2基因序列（DQ104423），應用Primer Premier 5.0軟件，設計1對特異性引物，擴增PCV2的515 bp基因片段。引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物：5′-GTGGTTGTTATTGATGAC -3′，下游引物：5′-AATCAGCTTTG GCTGAGGC-3′。

1.4PCV2基因組DNA的提取

按AxyPrep體液病毒DNA小量試劑盒的使用說明書提取PCV2 的DNA，并提取PCV1、CSFV、PRRSV、PPV、PRV、JEV等病毒的核酸。

1.5PCV2的PCR反應條件的確立

以提取的PCV2 DNA作為模板，進行PCR反應，擴增。在其他條件不變的情況下，對反應的退火溫度進行優化，分別采用40、42、44、46、48及50℃6種不同的退火溫度進行擴增；在其他條件不變的情況下，對反應的引物濃度進行優化，分別采用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、及1.2 μmol/L 6種不同引物濃度進行擴增。反應體系保持為25 μL，PCR反應的條件保持不變，為95℃預變性5分鐘，95℃30秒、46℃30秒，72℃30秒，共30個循環，最后72℃延伸10分鐘。

1.6PCR擴增產物的檢測及鑒定

取5 μL PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，紫外燈下觀察擴增結果。如果有目的條帶，則切下目的條帶，按照DNA凝膠回收試劑盒的說明書操作，回收目的片段。將回收后的片段與pMD18-T連接。將連接產物轉化大腸桿菌感受態DH5α，37℃過夜培養后，挑取單菌落搖菌過夜，按質粒提取試劑盒的說明書抽提培養菌液的質粒，用建立的PCR方法檢測質粒是否含有。如果含有，將提取的質粒發送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結果與參照的PCV2基因序列進行基因相似性分析。

1.7特異性試驗

分別提取PCV2、PCV1、CSFV、PRRSV、PPV、PRV、JEV等7種不同的病毒核酸作為模板，用已建立的PCR檢測方法進行擴增。

1.8敏感性試驗

提取PCV2基因組DNA，用儀器測定含量，然后10倍系列稀釋，使PCV2基因組DNA的含量分別為10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg 及0.1 pg。分別將其作為模板，用建立的方法分別進行PCR檢測擴增，確定PCR檢測方法的敏感性。

1.9重復性試驗

為了驗證所建立PCR檢測方法的重復性，分別提取3批PCV2陽性病料、陰性病料以及6種陰性對照病毒如PCV1、CSFV、PRRSV、PPV、PRV及JEV的核酸作為模板，進行PCR擴增反應。

1.10臨床樣品的檢測

提取臨床上送檢的35份PCV2疑似病料的基因組DNA為模板，用建立的PCR檢測方法擴增檢測。

2　結果與分析

2.1擴增產物的檢測

用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果在約515 bp出現目的DNA條帶（圖1），和預期大小一致。

圖1　PCV2擴增結果

2.2特異性試驗

利用所設計的引物及所確定的最佳反應條件分別對PCV2、PCV1、CSFV、PRRSV、PPV、PRV和JEV進行PCR擴增。結果7個毒株中只有PCV2能擴增出相應的片段，大小為515 bp(預期515 bp)，而其他均未擴增出相應的片段（圖2）。說明本研究建立的方法特異性很好。

圖2　特異性試驗

2.3敏感性試驗

用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分別檢測5 μL PCR擴增產物，1～5號樣品產物在515 bp位置均有目的條帶，6號樣品產物無擴增條帶。結果顯示，引物的檢測靈敏度可達1 pg DNA（圖3）。

圖3　敏感性試驗

2.4重復性試驗

重復性試驗結果顯示，3批不同病料的檢測結果相同，說明建立的PCR檢測方法重復性好、可靠、穩定。

2.5臨床樣品的檢測

用建立的方法檢測的35份臨床疑似PCV2病料中，有10份結果呈陽性。

3　討論

本試驗對GenBank公布的PCV2基因序列進行比對，發現PCV2相對比較保守，查找出其高度保守區域，參照GenBank中登錄的PCV2基因序列（DQ104423），利用Primer Premier5.0設計1對引物，通過PCR擴增出目的基因，連接到pMD18-T載體，送樣測序，對測序結果與模板序列進行比對，其同源性為100%。對退火溫度優化，發現只有當退火溫度為46℃時，才能獲得較為理想的產物，其他溫度即使相差2℃也不能獲得理想的試驗結果。對引物濃度進行優化，在引物濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0及1.2 μmol/L時不影響PCR反應的擴增效率，擴增效率相對較高的引物濃度為0.6μmol/L，擴增效率相對較低的引物濃度為1.2μmol/L。敏感性試驗結果顯示，本檢測方法的靈敏度可以達到1 pg DNA。本試驗所建立的PCV2 PCR檢測方法能夠擴增出515 bp目的片段，而對常見的豬病病毒，如PCV1、CSFV、PRRSV、PPV、PRV 和JEV均無擴增產物，證明本方法具有很好的特異性。用建立的PCV2 PCR檢測方法，檢測35份臨床疑似PCV2病料，檢出10份PCV2陽性病料。因此，本試驗為PCV2的流行病學調查和檢測提供了一種簡單、快速和有效的檢測方法。

參考文獻

[1] Clark EG. Post -weaning multisystemic wasting syndrome [J]. Proceeding of the American Association of Swine Practitioners, 1997(28):499-501.

[2]游一,許保疆,王克領,等.規模化豬場豬圓環病毒病的診斷及綜合防制[J].中國畜牧獸醫, 2009, 36(9):152-154.

[3]殷震,劉景華.動物病毒學[M].第2 版.北京:科學出版社, 1997:1175-1182.

[4] Harms PA, Sorden SD, Halbur PG. Three cases of porcinerespiratory disease complex associated with porcine circovirustype2 infection [J]. Swine Health and Production, 2002(38):528-539.

[5] Neumann EJ, Dobbinson, Welch EB, et al. Descriptive sum-mary of an outbreak of porcine post -weaning multisystemicwasting syndrome (PMWS) in New Zealand [J]. New Zeal-and Veterinary Journal, 2007 (55):346-352.

中圖分類號：S828.28

文獻標識碼：B

文章編號：1673-4645(2015)03-0048-03

收稿日期：2014-11-27

基金項目：山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目(SDAIT-06-011-14)

作者簡介：于新友(1983-)，男，漢族，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動物傳染病診斷技術研究，Email:yuxinyou_2006@126.com