雨生紅球藻中蝦青素的提取工藝優化

李小慧　鄒寧　孫東紅等

摘要

[目的]探索大規模工業生產適用的蝦青素提取方法。[方法]從原料的狀態入手，采用常規的有機溶劑——丙酮作提取劑，對新鮮雨生紅球藻膏和干藻粉中蝦青素的提取率進行比較。[結果]使用目前采用的提取條件，從干藻粉中得到的蝦青素提取率為新鮮藻膏的2倍多。[結論]烘干后的雨生紅球藻在蝦青素的提取中具有更大的優勢。

關鍵詞 雨生紅球藻；蝦青素；新鮮藻膏；干藻粉；提取工藝優化

中圖分類號 S188 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2015）15-023-02

Optimization of Productional Astaxanthin Extraction Process from Haematococcus pluvialis

LI Xiaohui， ZOU Ning，SUN Donghong et al （Lu Dong Univercity of Life Science，Yantai，Shandong 264025）

Abstract [Objective]In order to explore the applicative extraction process of largescale production of astaxanthi. [Method] The different states of Haematococcus material were compared in this work. With conventional organic solvent as extracting agent， the extraction rates of astaxanthin from fresh paste and dry power of Haematococcus pluvialis were compared. [Result]The results showed that，at the current extraction conditions， the extraction rate of astaxanthin obtained from dry powder was about 2 times more than fresh paste. [Conclusion] Dry Haematococcus pluvialis had more advantages in Productional astaxanthin extraction process.

Key words Haematococcus pluvialis； Astaxanthin； Fresh paste； Dried powder； Optimization of extraction process

雨生紅球藻中蝦青素的含量高達1.5%～3.0%。蝦青素是一種高效純天然抗氧化劑，其主要作用是清除人體內的自由基，并能提高人體抗衰老能力。目前，人們公認的天然蝦青素的生物來源有3種：蝦、蟹等水產品的廢棄物，紅發夫酵母及雨生紅球藻。其中，蝦、蟹等水產品的廢棄物中，蝦青素不僅含量低，而且提取費用高；而天然紅發夫酵母中蝦青素的平均含量僅為0.4%；因此，雨生紅球藻被確認為自然界中生產天然蝦青素的最好生物來源[1]。其天然抗氧化性是類胡蘿卜素的10倍、VE的550倍。因此，蝦青素在保健食品、藥品、高檔化妝品、生物醫藥制劑以及飼料添加劑等領域有很大需求和應用前景。

近年來，隨著對雨生紅球藻研究的深入開發和發展，越發凸顯出其經濟和利用價值，其社會地位和開發價值也日趨上升。而目前最關鍵的是對蝦青素的生產性提取工藝進行優化。大規模生產蝦青素的提取費用很高，從而制約了利用雨生紅球藻生產蝦青素的開發和利用，因此，蝦青素的提取工藝優化迫在眉睫。

在蝦青素提取過程中，從雨生紅球藻細胞中萃取蝦青素是通過有機溶劑經細胞壁進入細胞，使色素溶解于有機溶劑中，從而通過擴散作用進入溶液，這是一種固-液萃取的過程。由于雨生紅球藻的細胞壁很厚且存在膠質，阻礙了提取溶劑向細胞內滲透，加大了蝦青素的提取難度。因此，在提取蝦青素前要對雨生紅球藻進行破壁處理，破壁效果的好壞直接影響到蝦青素提取量的多少。筆者采用旋渦振蕩破壁，在破壁過程中間歇振蕩，為的是使細胞在振蕩上浮之后重新下沉，使破壁更加完全。在破壁之前加入5～8粒小玻璃珠，保證破壁完全。依據前人研究蝦青素的方法[2-14]，筆者用干藻粉和新鮮藻膏提取蝦青素，比較蝦青素的提取率。

1 材料與方法

1.1 材料

所用雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）藻種和新鮮藻液為魯東大學大境藻類研究所提供。

1.2 儀器

分光光度計（UV2000）、快速混勻器（SK1）、移液槍（X40957）、恒溫水浴鍋（HHS）、電子天平（FA1104）、超凈工作臺、冰箱（BCD205TA）、顯微鏡（CX21）、臺式離心機（TGL16C）

1.3 蝦青素含量的測定方法 取樣用分光光度計在可見光560 nm處測定其生物量，用血球計數板計數細胞數。經多次蝦青素吸光度的標定，在波長為473 nm處，蝦青素的吸光度達到峰值，因此，該試驗蝦青素的吸光度在波長473 nm下測定。

蝦青素含量的測定步驟：①搖勻培養液， 用移液管分別吸取1 ml樣液，置于潔凈的離心管中編號1～4號，以4 000 r/min的速度離心5 min，棄去上清液，只保留沉淀。分別稱取雨生紅球藻干藻粉0.6 mg，分別編號5～8。 ②向第一步得到的沉淀和干藻粉各樣品中分別加入1 ml 100%的丙酮，再加入等量的5～8個玻璃珠，在振蕩混勻器上振蕩混勻1 min，在振蕩混勻過程中用鋁箔包住離心管以避光。振蕩完成后再加入2 ml提取劑，振蕩混勻。

③將上述1～8號離心管先放入80 ℃的水浴中保溫1 min，冷卻至室溫后再轉移到0～4 ℃的條件下浸提1 h。④浸提后在4 000 r/min下離心5 min，取上清液，分別移至10 ml定容管中。⑤重復步驟②～④3次，將3次提取的上清液合并，每次分別移入相同編號的定容管中并定容至10 ml，混勻。在波長400～700 nm的可見光范圍內測定吸光度，并記錄測得的數值。

1.4 蝦青素含量的計算方法 在473 nm波長下測定最大吸光值，提取劑作為空白對照。如果吸光值大于0.9，則必須對樣品用提取劑稀釋后再測定，并用下列公式計算所測溶液中蝦青素的含量[15]：

類胡蘿卜素質量（mg/g）= A473×25 ml（丙酮）×稀釋倍數/250

蝦青素（mg/g）=（類胡蘿卜素質量（mg）×80%）/樣品質量（g）

蝦青素（g/L）= （類胡蘿卜素質量（mg）×80%）/25 ml×8

1.5 鮮藻干重的測定方法

將稱量紙置于培養皿中，于105 ℃下烘干24 h至恒重，記錄稱量紙的質量m1；用移液槍取4.5 ml的藻液于布氏漏斗中抽濾，同樣置于培養皿中，于105 ℃下烘干24 h至恒重，記錄其質量m2；

鮮藻的干重：m= m2-m1。

用該方法最終測得所用鮮藻的平均干重為（6.1±1.2）g/L。

2 結果與分析

雨生紅球藻培養結束后其細胞密度的平均值為1×106個/ml，在波長560 nm下的OD值為0.123。

從雨生紅球藻干藻粉和新鮮藻膏提取得到的蝦青素含量見表1。從表1可以看出，干藻粉相比新鮮雨生紅球藻膏蝦青素的提取率及提取質量均提高了2倍多。由烘干后的雨生紅球藻藻粉提取蝦青素具有更大的優勢。新鮮藻膏提取蝦青素所用的藻液體積為1 ml，其干重為6.1 g/L，所提取的蝦青素質量為0.136 mg/L，提取率為6.96 mg/g、干藻粉提取蝦青素所用的干粉質量為0.6 mg，所提取的蝦青素質量為0.300 mg/L，提取率為15.60 mg/g。

3 結論與討論

（1）目前蝦青素的提取主要是通過有機溶劑浸提的方法。原料狀態的選擇會影響蝦青素的提取速率。因為烘干后的干藻粉和新鮮藻膏在提取時細胞所處的環境不同，因此提取蝦青素的效果也不同。蝦青素不溶于水，用新鮮藻膏來提取蝦青素，有水分的存在下，會影響破壁的效果和蝦青素的提取效率，同時加入有機溶劑親水性差，不容易進入細胞，所以提取率不高。而烘干后的干藻粉，細胞處在無水的條件下加入有機提取劑，則細胞容易破壁，蝦青素容易溶入有機溶劑中，因此，提取率較高，提取效果好。

（2）試驗所用藻液的體積為1 ml，其干重為6.1 g/L，所用干藻粉的質量為0.6 mg，提取劑均用丙酮作有機溶劑。經計算得到新鮮藻膏提取蝦青素的含量為6.96 mg/g，蝦青素的質量為0.136 mg/L；固體干藻粉得到的蝦青素含量為15.6 mg/g，蝦青素的質量為0.300 mg/L。比較發現，干藻粉相比新鮮的雨生紅球藻蝦青素的提取率及提取含量均提高了2倍多。烘干后的雨生紅球藻在蝦青素的提取中具有更大的優勢。

（3）從雨生紅球藻中提取蝦青素，通常都是用新鮮的藻膏進行提取，該研究用烘干后的藻粉和新鮮的雨生紅球藻進行試驗，通過對蝦青素提取率的比較得出，用烘干后的雨生紅球藻，其蝦青素的提取率及提取含量都比用新鮮藻膏提取的高。

（4）丙酮是蝦青素提取中較常用的提取劑，操作方法也較成熟，是目前有機溶劑中提取率較高的溶劑。因此該試驗選取丙酮作提取劑，保證蝦青素較高的提取率，然后再對其進行新鮮藻膏和固體干藻粉的比較，且新鮮的藻膏不宜儲存、易污染，蝦青素易氧化，而干藻粉則相對易保存和運輸，對今后的大規模生產具有參考價值。

參考文獻

[1]

李冬玲. 極具經濟價值的微藻——雨生紅球藻[J].特種經濟動植物，2014（3）：42-46.

[3] 劉曉娟，伍穎華，何鳳林，等.響應面法優化雨生紅球藻中蝦青素的提取條件[J].食品科技， 2012（2）：233-238.

[4] 柴建，新萬茵，付桂明，等.雨生紅球藻中總蝦青素提取工藝優化[J].中國食品添加劑，2011（3）：107-111.

[5] YUAN J P，CHEN F.Chromatographic separation and purification of astaxanthin from the extracts of Haematococcus pluvialis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1998， 46： 3371-3375.

[6] 許培雅，章銀軍.蝦殼蝦青素提取工藝的研究[J].糧食與飼料工業，2003（2）：27-28.

[7] 孟春曉，高政權，王依濤，等.雨生紅球藻中蝦青素提取方法研究現狀[J].水產科學，2010，29（12）：745-748.

[8] 莊惠如， 盧海聲. 雨生紅球藻營養細胞的蝦青素累積[J]. 水生生物學報，2001，25（4）：376-379.

[9] 歐陽琴，陳興才，黃亞志，等. 雨生紅球藻蝦青素的提取工藝條件研究[J].福建輕紡，2003，175（12）：9-13.

[10] 黃水英.雨生紅球藻的培養及其蝦青素的提取、穩定性和應用研究[D]. 廈門：廈門大學，2008.

[11] 劉偉. 雨生紅球藻規模化培養工藝的構建及相關生物學特性的研究[D].青島：中國科學院研究生院（海洋研究所），2006.

[12] 顧洪玲.雨生紅球藻的高效培養及其蝦青素的提取與純化[D].青島：中國海洋大學，2014：34-38.

[13] 李婷，韓麗君，袁毅.不同有機溶劑對雨生紅球藻中蝦青素提取成分的影響[J].海洋科學，2012，36（7）：34-38.

[14] HIGUERACIAPARA I，FELIXVALENZUELA，GOYCOOLEA F M.Astaxanthin： A review of its chemistry and applications[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 2006，46（2）： 185-196.

[15] DOMINGUEZBOCANEGRA A R，PONCENOYOLA T，TORRESMUNOZ J A. Astaxanthin production by Phaffia rhodozyma and Haematococcus pluvialis： A comparative study[J]. Applied Microbiology and Iotechnology，2007，75（4）：783-791.