紅茶菌和中草藥紅茶菌體外抑制霍亂弧菌的研究

蔣小強　邱紅輝　符乃方等

摘要[目的] 研究紅茶菌和中草藥紅茶菌在體外對霍亂弧菌的抑制作用。 [方法] 采用試管稀釋法（MIC），研究紅茶菌與中草藥紅茶菌對霍亂弧菌的體外抑制作用。 [結果] 紅茶菌與中草藥紅茶菌對霍亂弧菌都具有一定的抑菌作用，尤其是中草藥紅茶菌原液對高濃度的霍亂弧菌具有顯著的抑菌作用。[結論]與紅茶菌相比，中草藥紅茶菌對霍亂弧菌具有顯著的抑菌作用，在臨床上可用于對霍亂弧菌感染的預防。

關鍵詞紅茶菌；中草藥紅茶菌；霍亂弧菌；抑制

中圖分類號S188+.4文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）07-004-03

Study on Inhibition of Vibrio cholerae by Kombucha and Chinese Herbal Kombucha in vitro

JIANG Xiao-qiang1， QIU Hong-hui1， FU Nai-fang2， JIANG Sheng-jun2* et al

（1. Center for Animal Disease Control and Prevention， Dongfang Animal and Husbandry Bureau， Dongfang， Hainan 570100； 2. Tropical Crop Germplasm Resources Institute， China Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou， Hainan 571737）

Abstract[Objective] To study the inhibitory effects of Vibrio cholerae by kombuchab and Chinese herbal kombucha in vitro. [Method] Using the tube dilution method to study the inhibition effect of Vibrio cholerae by kombuchaand Chinese herbal kombucha in vitro. [Result] Both Kombucha and Chinese herbal kombucha have antibacterial effects for Vibrio cholerae， and Chinese herbal Kampuchea has strong antibacterial effect for Vibrio cholerae with high concentration. [Conclusion] Compared with kombucha， Chinese herbal Kombucha has antibacterial effect significantly on Vibrio cholerae， which would be used to prevent clinical infection of Vibrio cholerae.

Key wordsKombucha； Chinese herbal kombucha； Vibrio cholerae； Inhibition

紅茶菌保健飲料是一種由醋酸桿菌、酵母菌和乳酸菌等發酵紅茶糖水所形成的微生態茶飲料。國內外醫學界多年的研究和醫學實踐表明，飲用紅茶菌飲料能有效預防和治療多種慢性疾病，如預防癌癥、治療消化不良、緩解關節炎、治療高血壓等[1]。此外，紅茶菌自身不僅易于存活和繁殖，而且具有很強的殺菌、拮抗和抑菌作用[2]。紅茶菌的主要抑菌成分為有機酸、茶葉提取液成分以及紅茶菌產生的抑菌蛋白成分[3-9]。為了進一步增強紅茶菌的抑菌活性，除添加茶葉外，還添加甘草、菊花、羅漢果、啤酒花等中草藥，制備出新型中草藥紅茶菌制劑[10]。霍亂弧菌是一種能特異引起人體劇烈腹瀉癥狀的病菌。霍亂弧菌的主要致病機理是它主要分泌霍亂腸毒素與小腸黏膜上皮受體結合且進入細胞膜，作用于腺昔酸環化酶，使得ATP轉變為cAMP，小腸上皮細胞分泌功能亢進，導致嚴重腹瀉和嘔吐[11]。Toda等[12]研究表明，紅茶提取物對霍亂弧菌V569B 和V8 6 在1 h內均可殺滅，特別是V569B幾乎在接觸后立刻被殺滅。紅茶提取物還可以在體外和體內試驗中破壞霍亂毒素的作用。在體內試驗中，紅茶抽提物在CT 處理后5～30 min內均能抑制毒素作用，而在30 min 以后則無此效果。Toda等[13]進一步研究表明，兒茶素類在生物模型中也具有以上作用。在發達國家，由于衛生水平的提高，霍亂弧菌導致的病例日漸減少；但是，在發展中國家，霍亂弧菌導致的病例居高不下。雖然利用霍亂疫苗可以有效地預防霍亂，但是由于有效期短以及經濟原因而難以在這些發展中國家推廣。因此，探索利用低成本、高效的中草藥微生態制劑預防霍亂，是值得研究發展的方向。霍亂弧菌的最適培養pH為6.5～7.5，屬于喜歡偏中性以及弱堿性的病原菌。因此，能夠產生大量有機酸以及耐酸性強的益生菌都能有效地抑制或拮抗霍亂弧菌。紅茶菌包含自然界產酸性最強的醋酸菌，因此紅茶菌能有效地抑制霍亂弧菌[6-7，9] 。為了比較紅茶菌和中草藥紅茶菌的抑菌特性，筆者以霍亂弧菌標準株試驗菌種研究紅茶菌和中草藥紅茶菌對霍亂弧菌的抑菌效果，為臨床上預防霍亂弧菌的感染提供理論和技術支持。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種O139群霍亂弧菌國際標準株MO45（Vibrio cholerae O139 international reference strain MO45）。該菌種由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所腹瀉病室鑒定、保存和提供。紅茶菌制劑和中草藥紅茶菌制劑為本實驗室制備[10]。過濾的紅茶菌制劑和中草藥紅茶菌制劑用一次性微孔濾膜過濾器過濾。

1.1.2培養基。

慶大霉素瓊脂，用于霍亂弧菌的選擇性培養，購自北京陸橋技術有限公司。LB培養基和MH肉湯培養自己配置。

1.2方法

1.2.1細菌培養。

將菌種O139群霍亂弧菌國際標準株MO45接種到LB液體培養基上振蕩培養，接著接種到慶大霉素瓊脂選擇培養基，挑單菌落接種到5 ml肉湯培養基中，振蕩培養24 h后的菌液用于試驗。

1.2.2調配致病菌懸液。

將肉湯培養基上培養的霍亂弧菌分別置于生理鹽水管中，充分混勻，校正濃度至0.5麥氏濁度（約1×108 cfu/ml）和5.0麥氏濁度（1×109 cfu/ml）。

1.2.3

采取試管稀釋法確定中草藥紅茶菌的抑菌濃度。

每排安排6只2 ml的離心管，除每排第1支離心管外，每只離心管內加已高壓滅菌的MH肉湯1 ml，每排的第1、2管分別加入2 ml受試物，依次對倍稀釋至第7管，此時試管里的紅茶菌制劑或中草藥紅茶菌制劑濃度依次是1∶1、1∶2、1∶4和1∶8，第6管作為測試菌生長質控，然后每管加入3.6 μl 0.5麥氏濁度或5.0麥氏濁度的測試菌液，用振蕩器混合均勻，在37 ℃培養箱中靜止培養12 h后，取出一環接種慶大選擇培養基。根據是否有病原菌生長，確定微生態制劑對測試菌的抑菌效果。

1.2.4共培養時間對紅茶菌和中草藥紅茶菌體外抑制霍亂弧菌的影響研究。

每排安排5只2 ml離心管，每只離心管內加1 ml紅茶菌原液、紅茶菌稀釋液、中草藥紅茶菌原液和稀釋液，然后每管加入3.6 μl 5.0麥氏濁度的測試菌液，用振蕩器混合均勻，在37 ℃培養箱中靜止培養1、2、4、8、12 h后，每個小時取出一環接種慶大選擇培養基。根據是否有病原菌生長，確定共培養時間對微生態制劑抑菌效果的影響。

1.2.5紅茶菌原液和中草藥紅茶菌原液對接種大劑量、高濃度霍亂弧菌的體外抑制作用的研究。

為了探索通過口服紅茶菌和中草藥紅茶菌預防霍亂弧菌感染的可能性，每排安排6只2 ml的離心管，每只離心管內加1 ml紅茶菌原液、中草藥紅茶菌原液，然后每管加入5、10、20、50、100、200 μl 5.0麥氏濁度的測試菌液，用振蕩器混合均勻，在37 ℃培養箱中靜止培養12 h后，取出一環接種慶大選擇培養基。根據是否有病原菌生長，確定微生態制劑的抑菌效果。

2結果與分析

2.1過濾滅菌的紅茶菌和中草藥紅茶菌對接種低濃度霍亂弧菌的體外抑制作用

由表1可知，1 ml過濾滅菌的紅茶菌和中草藥紅茶菌菌液中接種3.6 μl麥氏濁度0.50的霍亂弧菌，培養12 h后接種霍亂弧菌選擇性培養基，過濾滅菌的紅茶菌原液、1∶1、1∶2稀釋的過濾滅菌的紅茶菌原液都能有效抑制所添加的霍亂弧菌的生長；過濾滅菌的中草藥紅茶菌原液、1∶1、1∶2、1∶4過濾滅菌的中草藥紅茶菌原液也都能有效抑制所添加的霍亂弧菌的生長，其余處理包括對照都有霍亂弧菌生長。這表明過濾滅菌的紅茶菌制劑以及1∶1、1∶2稀釋液能夠有效殺滅低濃度的霍亂弧菌，其余稀釋液不能完全殺滅低濃度的霍亂弧菌；相對于紅茶菌，過濾滅菌的中草藥紅茶菌的抑菌效果比相應的紅茶菌制劑強1倍左右。

表1過濾滅菌紅茶菌和中草藥紅茶菌對低濃度霍亂弧菌的體外抑制效果

類別稀釋比01∶11∶21∶41∶8CK

紅茶菌---+++++++++

中草藥紅茶菌----++++++

注：“-”表示霍亂弧菌顯色培養基中無霍亂弧菌生長；“+++”表示霍亂弧菌顯色培養基中有大量霍亂弧菌生長。

2.2紅茶菌和中草藥紅茶菌對接種高濃度霍亂弧菌的體外抑制作用

由表2可知，1 ml紅茶菌和中草藥紅茶菌菌液及其稀釋液中接種3.6 μl麥氏濁度5.0的霍亂弧菌，培養12 h后接種霍亂弧菌選擇性培養基，紅茶菌原液、1∶1、1∶2稀釋紅茶菌原液都能有效抑制所添加的高濃度霍亂弧菌的生長；中草藥紅茶菌原液、1∶1、1∶2、1∶4的中草藥紅茶菌原液也都能有效抑制所添加的高濃度霍亂弧菌的生長，其余處理包括對照都有霍亂弧菌生長。這表明紅茶菌原液以及1∶1、1∶2稀釋液能夠有效殺滅高濃度的霍亂弧菌，其余稀釋液不能完全殺滅高濃度的霍亂弧菌；相對于紅茶菌，中草藥紅茶菌的抑菌效果比相應的紅茶菌制劑強1倍左右。

表2紅茶菌和中草藥紅茶菌對高濃度霍亂弧菌的體外抑制效果

類別稀釋比01∶11∶21∶41∶8CK

紅茶菌---+++++++++

中草藥紅茶菌----++++++

注：“-”表示霍亂弧菌顯色培養基中無霍亂弧菌生長；“+++”表示霍亂弧菌顯色培養基中有大量霍亂弧菌生長。

2.3共培養時間對紅茶菌和中草藥紅茶菌抑制霍亂弧菌效果的影響

由表3可知，共培養1 h后，即無霍亂弧菌生長，表明紅茶菌制劑、中草藥紅茶菌制劑能快速殺滅或抑制霍亂弧菌的生長。這也證明霍亂弧菌是對酸非常敏感的病原細菌。

表3共培養時間對紅茶菌和中草藥紅茶菌制劑抑制霍亂弧菌效果的影響

類別共培養時間∥h124812

紅茶菌原液-----

1∶1稀釋紅茶菌液-----

1∶2稀釋紅茶菌液-----

中草藥紅茶菌原液-----

1∶1稀釋中草藥紅茶菌液-----

1∶2稀釋中草藥紅茶菌液-----

注：“-”表示霍亂弧菌顯色培養基中無霍亂弧菌生長。

2.4紅茶菌原液和中草藥紅茶菌原液對接種大劑量、高濃度霍亂弧菌的體外抑制作用

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