棉花SVP瞝ike基因獹hMADS29的克隆與表達分析

張文香　龐朝友　范術麗等

摘要 [目的]研究棉花中SVP類基因的功能。[方法]通過同源克隆的方法在陸地棉中棉所36中克隆SVP的同源基因GhMADS29，對其進行Blast搜索比對和進化樹分析以及熒光定量的表達模式分析。[結果]GhMADS29與獼猴桃的SVP4基因相似度最高，其cDNA序列含有9個外顯子、8個內含子，不同時期頂芽的熒光定量結果表明它在花芽分化起始期的花芽中表達量最高，且不同組織的熒光定量分析表明它在葉片和頂芽中表達量較高。[結論]首次獲得棉花SVP亞族基因，命名為GhMADS29，其GeneBank登錄號為JQ682642。

關鍵詞 SVP；熒光定量；開花

中圖分類號 S562 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2015）15-028-04

Molecular Cloning and Expression Analysis of SVPlike Gene，GhMADS29 from Gossypium hirsutum L.

ZHANG Wenxiang1，2，PANG Chaoyou1，FAN Shuli1，YU Shuxun1* et al

（1.Cotton Research Institute，Chinese Academy of Agriculture Sciences，Anyang，Henan 455000； 2.School of Chemistry and Life Science，Guizhou Normal University，Guiyang，Guizhou 550018）

Abstract [Objective] To study SVP gene from cotton.[Method] The SVP homologue gene GhMADS29 was cloned from CCRI 36 upland cotton by homology cloning strategy.Blast alignment，phylogenetic tree and quantitative RTPCR were conducted to analyze GhMADS29.[Result] It was showed that GhMADS29 was most similar to SVP4 from kiwifruit and that GhMADS29 had nine exons and eight introns.GhMADS29 expressed highest in 2SAM （shoot apical meristems at the second true leaf expanded stage） at which stage flower bud initiated differentiation.Expression analysis in different tissues showed that GhMADS29 expressed very highly in leaves and apical buds.[Conclusion] GhMADS29 is belong to SVP subfamily obtained for the first time in cotton and the accession number is JQ682642.

Key words SVP； Quantitative RTPCR； Flowering

擬南芥中的SVP和AGL24都屬于STMADS11亞族，它們序列高度保守，在花器官分生組織決定方面具有相同的功能，但在控制開花時間的功能上卻是相反的：AGL24是開花促進因子[1-2]，而SVP卻是開花抑制因子[3]。svp突變體通過縮短營養生長階段促進了開花[3]，研究表明SVP是開花溫度途徑中一個很重要的調節因子，它會調節開花促進因子miRNA172在不同溫度的表達水平[4]。水稻的STMADS11亞族基因OsMADS55在野生型擬南芥中過表達后，會使擬南芥開花時間推遲，花發育也發生改變，而另一該亞族的基因OsMADS22在擬南芥中過表達后，卻不會影響開花時間，只是花器官發生變異。但這2個基因都不能回復svp和agl24突變體的表型[5]。

短季棉是指生育期較短的陸地棉品種，是隨著生態環境與農業種植制度的變化，與一定的社會經濟條件、生產發展水平、科學技術發展水平相適應逐步形成發展起來的[6]。棉花的早熟性與多個農藝性狀有關，如株高、第一果枝節位、苗期、蕾期、花期、鈴期、開花縱間隔期、橫間隔期等[7]，而且隨著科學的發展進步，分子育種成為當前的熱點，因此筆者根據其他作物中已有功能驗證的且確定具有調控開花時間功能的MADS基因，確定SVP類基因為研究對象，以期能夠明確這些基因的功能，從而為短季棉培育提供良好的基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。以棉花早熟品種中棉所36為試驗材料，種植于中國農業科學院棉花研究所老所部試驗田，按大田常規管理辦法進行管理。分別取子葉展平（OSAM）、第一真葉展平（1SAM）、第二真葉展平（2SAM）、第三真葉展平（3SAM）時的頂芽，以及盛花期的頂芽、根、莖、葉、苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、開花后10 d的胚珠和纖維。所取材料立即投入液氮中冷凍，然后于-70 ℃冰箱保存備用。

1.1.2 主要試劑。大腸桿菌DH5α感受態細胞購自北京天根公司，農桿菌LBA4404為中國農業科學院棉花研究所早熟課題組保存；培養基中的酵母粉、蛋白胨和瓊脂粉購自Oxoid公司；pGEMT easy克隆載體購自Promega公司，常規生化試劑，如Taq DNA聚合酶、限制性內切酶等，均購自大連寶生物工程公司；RNA提取試劑盒購自北京天根公司；反轉錄試劑盒購自美國Invitrogen生物技術有限公司；膠回收及DNA提取試劑盒購自上海生物工程公司；質粒提取試劑盒購自Omega生物技術公司。

1.1.3 主要儀器。PCR儀、電泳儀、超凈工作臺、紫外凝膠成像系統、DU800核酸蛋白分析儀、自動蒸汽消毒鍋、超低溫冰箱、高速冷凍離心機、冷凍臺式離心機等。

1.2 方法

1.2.1 棉花RNA的提取。按照北京天根公司的RNA提取試劑盒操作說明進行。

1.2.2 引物設計與基因克隆。以擬南芥SVP和AGL24基因為參考序列，Blast搜索棉花的EST數據庫（NCBI棉花 EST數據庫網址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/？term=cottonTIGR棉花 EST數據庫網址：http：//compbio.dfci.harvard.edu/cgibin/tgi/cat_download.pl？db=cottest），將得到的EST進行拼接，得到含有完整閱讀框的cDNA序列，根據此序列設計引物，引物需包含完整的開放閱讀框（ORF），引物序列：29F：5′ ACCTCACTTCTTCACACTTTCTTCC3′，29R：5′ TCTTCGCAACATCACCGCCTTTTAACC3′。

根據大連寶生物公司Taq DNA聚合酶說明書配制PCR反應體系，總體積為25.00 μl， 其中ExTaq酶0.15 μl，10×ExTaq Buffer 2.50 μl，10 mmol/L dNTP mixture 2.00 μl，引物（20 μmol/L）各1.00 μl，模板2.00 μl。PCR擴增程序：95 ℃預變性 4 min；95 ℃變性 45 s，54 ℃退火 40 s，72 ℃延伸50 s，33個循環；72 ℃延伸 5 min。

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，以天根公司的MarkerIII為參照，若條帶大小與預期結果相近，則回收目的片段，送金唯智公司測序。

1.2.3 熒光定量PCR。參照Roche公司的FastStart Universal SYBR Green Master試劑盒說明書和ABI （Applied Biosystems）公司的ABI 7500熒光定量PCR儀進行。以GhACTIN （GenBank：AY305733）作為內參，以控制誤差。熒光定量引物序列：Q29F：5′GCATCGACAGATCGGTCACCAG3′；Q29R：5′CGTCTCAAGCCTCCTTCAACTA3′。actinF：5′ATCCTCCGTCTTGACCTTG3′；actinR：5′ TGTCCGTCAGGCAACTCAT3′。

PCR反應體系總體積25.0 μl ，其中SYBR Green PCR Master mix 12.5 μl，上下游引物各0.5 μl，cDNA 模板 2.0 μl。反應程序：50 ℃預變性2.0 min；95 ℃變性10 min，95 ℃退火10 s，65 ℃延伸30 s，40個循環；72 ℃延伸35 s。

2 結果與分析

2.1 GhMADS29基因的獲得

利用擬南芥SVP和AGL24的核酸序列Blast棉花EST數據庫，將得到的EST序列

通過CAP3在線拼接軟件進行拼接，根據拼接得到的序列設計引物，保證所設計引物跨越完整的ORF，以中棉所36的cDNA為模板進行擴增（圖1），回收目的條帶，連接到pGEMT Easy

載體，轉化大腸桿菌，通過藍白斑篩選和PCR鑒定為陽性的克隆，送公司測序，確定序列后，將序列提交到GeneBank數據庫，獲得登錄號JQ682642。

2.2 GhMADS29的序列分析

利用NCBI的ORF finder在線工具對其蛋白序列進行預測，發現其編碼228個氨基酸。用預測的蛋白序列Blast NCBI的nr數據庫，結果顯示GhMADS29與獼猴桃的SVP4相似度最高，一致性達到60%，由此猜測GhMADS29屬于SVP亞族（STMADS11亞族）。將GhMADS29與其他一些作物的SVP類基因進行序列比對，發現所預測的GhMADS29的蛋白序列在N末端比其他SVP基因都多出8個氨基酸（圖2），進一步分析核酸序列發現，得到的cDNA序列中包含2個ATG起始密碼子，且兩者之間的堿基數正好是3的倍數。將這些序列進行進化樹分析，同樣發現GhMADS29屬于STMADS11亞族，但聚類關系不是很近（圖3）。

用所得到的cDNA序列Blast雷蒙德氏棉的基因組序列，分析GhMADS29的基因結構。發現所得到的這段cDNA序列所對應的基因組序列含有9個外顯子、8個內含子（圖4），而且第一個起始密碼子位于第一個外顯子，第二個起始密碼子位于第二個外顯子，基因組全長11 466 bp。

2.3 GhMADS29的表達模式 由圖5A可知，在2SAM（第二片真葉展平）的花芽分化時期，GhMADS29的表達量最高，隨后的3SAM（第三片真葉展平）時期表達量也較高，但相比于2SAM，3SAM時期的表達量又有所下降。對GhMADS29進行不同組織的表達模式分析（圖5B），發現其在葉片中的表達量最高，頂芽次之，各個花器官中的表達量都較低，只有苞片和心皮相對較高。 GA處理后的表達分析發現（圖6），GhMADS29的表達量下降。

3 結論與討論

該研究以擬南芥中的SVP和AGL24基因為參考序列，Blast棉花EST數據庫后，通過EST拼接得到了GhMADS29的序列，與擬南芥SVP和AGL24序列比對發現，GhMADS29與SVP相似性更高，由此猜測GhMADS29可能與SVP具有相似的功能。

不同時期頂芽的表達模式分析發現，GhMADS29在二葉展平時期頂芽中表達量最高，推斷它可能與花芽的起始分化有關，不同組織的表達模式分析發現，GhMADS29在葉片中的表達量最高，頂芽次之，而且對棉花進行GA處理，也發現GhMADS29的表達量下降，因此猜測GhMADS29可能通過葉片和頂芽感受信號后表達量上調進而促進花芽分化且它可能與擬南芥SVP的作用模式相同，因為研究表明擬南芥SVP在葉片中與FLC形成二聚體調控SOC1和FT的表達[8]，進而調控植物開花，而且在感受到自主途徑、溫度途徑、GA途

徑的信號后，SVP在頂芽中的表達量下調[3，8-9]。通過不同組織的表達模式分析發現，GhMADS29在花器官中的表達量相對較低，因此猜測GhMADS29可能不參與花器官發育的調控。

該研究通過同源克隆的方法克隆到陸地棉中SVP類基因的完整開放閱讀框，命名為GhMADS29，并提交到GeneBank獲得登錄號為JQ682642。其在第二片真葉展平時表達量最高，且GA會抑制其表達。

參考文獻

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