RP—HPLC法同時測定六味地黃膠囊中3種成分含量

楊堃　鄭小平　阮陶仁

摘要 [目的]建立同時測定六味地黃膠囊中馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚3種成分含量的反相高效液相色譜法（RPHPLC）。[方法]以Waters ODS C18（ 4.6 mm×250 mm，5 μm）柱為分析柱、甲醇-0.1%磷酸為流動相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 ml/min，檢測波長芍藥苷和馬錢苷為230 nm、丹皮酚為274 nm，柱溫40 ℃。[結(jié)果]芍藥苷在0.066 5～1.663 2 μg、馬錢苷在0.107 9～2.697 7 μg、丹皮酚在0.122 4～3.060 0 μg范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.999 4、0.999 8、0.999 9，平均回收率為芍藥苷97.63%（RSD=0.82%）、馬錢苷97.66%（RSD=0.74%）、丹皮酚96.22%（RSD=1.21%）。[結(jié)論]該方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于六味地黃膠囊的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 六味地黃膠囊；芍藥苷；馬錢苷；丹皮酚；RPHPLC

中圖分類號 S-03 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）15-074-04

Simultaneous Determination of Three Constituents in Liuwei Dihuang Capusule by RPHPLC

YANG Kun1， ZHENG Xiaoping1， RUAN Taoren2*

（1. Chongqing Food and Drug Control Institute， Chongqing 401121； 2. Chongqing City Hospital of Traditional Chinese Medicine， Chongqing 401121）

Abstract [Objective] To establish RPHPLC method for simultaneous determining paeoniflorin， loganin and paeonol in Liuwei Dihuang Capsule. [Method] RPHPLC assay was carried out using a Waters ODS C18 （4.6 ×250 ，5 ） column.The mobile phase was consisted of methanol -0.1% phosphoric acid in gradient elution.The flow rate was 1.0 ml/min.The UV detection wavelength was set at 230 for paeoniflorin and loganin，and 274 for paeonol.The column temperature was 40 ℃. [Result] The linear ranges of paeoniflorin， loganin and paeonol were 0066 5-1.663 2 （r=0.999 4 ）， 0.107 9-2.697 7 （r=0.9998 ）， 0.122 4-3.060 0 （r=0.999 9 ）， respectively. The average recoveries of paeoniflorin， loganin and paeonol were 97.63% （RSD was 0.82%） ， 97.66% （RSD was 0.74%） ， and 96.22% （RSD was 121%） ， respectively. [Conclusion] The method is simple， accurate and reproducible. It can be used for the quality control of Liuwei Dihuang Capsule.

Key words Liuwei Dihuang Capsule； Paeoniflorin； Loganin； Paeonol； RPHPLC

六味地黃膠囊是由滋陰補(bǔ)腎的經(jīng)典代表方劑六味地黃丸改進(jìn)制劑方法而成的，是《中國藥典》2010版一部收載的常用復(fù)方制劑。六味地黃膠囊依然由熟地黃、酒萸肉、山藥、牡丹皮、茯苓和澤瀉六味中藥組成，只是改進(jìn)了制備方法，減少了服用量，易于保存和增加病人的依從性。所以六味地黃膠囊同樣具有滋陰補(bǔ)腎的功效，可用于腎陰虧損、頭暈耳鳴、腰膝酸軟、骨蒸潮熱、盜汗遺精的治療[1]。喻箴等通過臨床研究表明六味地黃膠囊總療效明顯優(yōu)于傳統(tǒng)劑型六味地黃丸[2]；韋詠蓮也通過臨床研究發(fā)現(xiàn)六味地黃膠囊治療2型糖尿病有助于控制血糖，減輕病情[3]。

2010版《中國藥典》記載采用高效液相色譜法測定六味地黃膠囊中丹皮酚的含量，用薄層掃描法測定熊果酸的含量[1]；遲富杰等采用HPLC法測定六味地黃膠囊中熊果酸含量[4-5]和丹皮酚的含量[6-7]；水彩紅等采用HPLC法測定六味地黃膠囊中馬錢苷的含量[8-9]和芍藥苷的含量[10]。這些方法均是對單一成分的檢查，而六味地黃膠囊中成分多，為提高其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，筆者參考和改進(jìn)了李向陽等對于六味地黃丸采用HPLC法進(jìn)行含量測定的方法[11-12]，從而建立了同時測定六味地黃膠囊中芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚3種成分的HPLC方法，為提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、全面評價其內(nèi)在質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 美國Waters2695型高效液相色譜儀；KQ500B型超聲波提取器（昆山市超聲儀器有限公司）；BP221S萬分之一分析天平（德國Sartorius）；AX205十萬分之一分析天平（瑞士METTLER TOLEDO）。

1.2 試藥 六味地黃膠囊（吉林省撫松制藥股份有限公司 0.3 g×24粒）；芍藥苷對照品（中國食品藥品檢定所，定量測定用，批號110736-201136）；馬錢苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，定量測定用，批號110640-201005）；丹皮酚對照品（中國藥品生物制品檢定所，定量測定用，批號110708-200505）；甲醇為色譜純；水為純化水，其余試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配置。

1.3.1.1 對照品溶液的制備。取芍藥苷和馬錢苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml分別含芍藥苷66.528 0 μg、馬錢苷107.906 5 μg的混合溶液，即得。取丹皮酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含丹皮酚122.4 μg的溶液，即得。

1.3.1.2 供試品溶液的制備。取同一批次樣品（批號120202 85），取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，超聲處理（500 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻，濾過，續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

1.3.2 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。色譜柱為Waters ODS C18（ 4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)，梯度洗脫，梯度洗脫程序如表1所示；體積流量1.0 ml/min；進(jìn)樣量10 μl ；檢測波長芍藥苷和馬錢苷為230 nm、丹皮酚為274 nm。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密吸取“1.3.1.1”項(xiàng)下的2種對照品溶液1、5、10、15、20、25 μl，分別注入液相色譜儀，測定芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚峰面積，以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 精密度試驗(yàn)。精密吸取“1.3.1.1”項(xiàng)下的2種對照品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣體積為10 μl，測定馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚峰面積，分別計(jì)算芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取“1.3.1.2”項(xiàng)下同一供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、15 h注入液相色譜儀，進(jìn)樣體積為10 μl，測定芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚峰面積，分別計(jì)算芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚峰面積的RSD。

1.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批次樣品（批號120202 85），按“1.3.1.2”方法平行制備6份供試品溶液，分別測得芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚的含量，并分別計(jì)算芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚峰面積的RSD。

1.3.7 加樣回收率試驗(yàn)。取已測定的六味地黃膠囊樣品（芍藥苷0.377 0 mg/粒、馬錢苷0.603 0 mg/粒、丹皮酚3.990 4 mg/粒），取約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入含芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚對照品的混合甲醇溶液（芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚的濃度分別為0.013 3、0.021 6、0.135 6 mg/ml）25 ml，以下按“1.3.1.2”項(xiàng)下制備方法操作，平行操作，制得6份加樣供試品溶液。吸取加樣供試品溶液10 μl，注入液相色譜儀，測定芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚，計(jì)算加樣回收率和RSD。

1.3.8 樣品含量測定。按“1.3.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定3個廠家六味地黃膠囊中芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚，平行測定3次，計(jì)算含量和RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 從圖1可看出，該方法所得對照品色譜峰峰形尖銳，對稱性好；供試品中的芍藥苷和馬錢苷色譜峰對稱性好，與前后其他峰分離度>1.5，可見芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚色譜峰與相鄰成分可達(dá)基線分離，且陰性試驗(yàn)無干擾，理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算不低于6 000，故該方法可行。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過以上色譜條件測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，數(shù)據(jù)經(jīng)過回歸處理，得芍藥苷、馬錢苷、丹皮酚的回歸方程分別為Y=9.0×104X-419（r=0.999 4）、Y=1.5×105X-1.5×104（r=0.999 8）、Y=6.7×105X-7.9×104（r=0.999 9），表明芍藥苷在0.066 5～1.663 2 μg、馬錢苷在0107 9～2.697 7 μg、丹皮酚在0.122 4～3.060 0 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn) 分別連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣體積為10 μl，測得馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為0.57%、045%和0.30%，表明該方法的精密度良好。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“1.3.5”方法操作，測得芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為0.32%、0.55%和0.46%，表明供試品溶液在15 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按“1.3.6”方法操作，測得芍藥苷、馬錢苷、丹皮酚的平均含量分別為0.377 0（RSD=0.28%）、0.603 0（RSD=0.57%）、3.990 4 mg/粒（RSD=1.20%），表明該方法重復(fù)性好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

由表2～4可見，芍藥苷、馬錢苷、丹皮酚的平均回收率分別為97.63%、97.66%、96.22%、RSD

分別為0.82%、0.74%、1.21%，均達(dá)到相關(guān)要求，說明該方

2.7 樣品含量測定 由表5可見，吉林撫松、四川泰華堂、修正藥業(yè)3個廠家的樣品用該方法均能檢出芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚及其含量，表明該方法準(zhǔn)確、可靠，可推廣用于六味地黃膠囊的質(zhì)量控制。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 試驗(yàn)前查參考文獻(xiàn)[13]得知芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚的最大吸收波長分別為230、236和274 nm。由于所用檢測器為雙波長檢測器，故丹皮酚選擇其最大吸收波長274 nm；而芍藥苷的最大吸收波長230 nm與馬錢苷的最大吸收波長236 nm比較接近，故通過試驗(yàn)選擇芍藥苷和馬錢苷共用的波長。取同一供試品溶液進(jìn)樣10 μl，分別在230和236 nm波長下測定芍藥苷和馬錢苷的含量，結(jié)果顯示（表6），由于230和236 nm 2個波長比較接近，所以含量測定時影響不大，但由于芍藥苷含量比馬錢苷低，所以選擇了芍藥苷的最大吸收波長230 nm為芍藥苷和馬錢苷的共用檢測波長。

3.2 流動相的選擇 由于是3種物質(zhì)同時進(jìn)行分離，芍藥苷、馬錢苷2個苷類物質(zhì)的極性與丹皮酚酚酸類物質(zhì)極性相差較大，如果僅采用等度洗脫，很難完全、快速地將3種物質(zhì)分離，故采用梯度洗脫。開始水相的比例較大，流動相極性較大，將同樣極性較大的芍藥苷和馬錢苷洗脫處理；然后再逐漸加大甲醇的比例，降低流動相極性，將極性較小的丹皮酚洗脫出來；最后由于六味地黃膠囊為中藥復(fù)方提取物，雜質(zhì)較多，反復(fù)進(jìn)樣，易導(dǎo)致色譜柱的柱效下降，且由于采用自動進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣后會出現(xiàn)雜質(zhì)峰干擾，因此最后用高濃度甲醇溶液沖洗雜質(zhì)一段時間。試驗(yàn)開始時使用的為0.05%的磷酸溶液，但芍藥苷色譜峰拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，故加大酸性，采用0.1%的磷酸溶液，峰型因此變得比較對稱。同時試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，芍藥苷與馬錢苷的極性比較接近，最開始采用的為甲醇∶0.1%磷酸（25∶75），兩峰大部分重合，逐漸增加水相比例，降低溶劑強(qiáng)度，比例為甲醇∶0.1%磷酸（20∶80）時才使兩峰達(dá)到基線分離。

3.3 提取溶劑的選擇

取同一批次樣品（批號120202 85），取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇和甲醇各25 ml，稱定重量，超聲處理（500 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用相應(yīng)溶劑補(bǔ)足減少的重量，搖勻，濾過，續(xù)濾液用0.45微孔濾膜濾過，分別測定芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚的含量。結(jié)果顯示（表7），以甲醇為提取溶劑時馬錢苷與丹皮酚的提取含量最高，以50%甲醇為提取溶劑時芍藥苷的提取含量最高，從含量以及操作方面綜合考慮，選擇甲醇為提取溶劑，與2010版中國藥典品種六味地黃膠囊采用溶劑無差別。

3.4 提取時間的選擇

取同一批次樣品（批號120202 85），取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，分別超聲處理（500 W，40 kHz）20、30、40 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻，濾過，續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過，分別測定芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚的含量。結(jié)果顯示（表8），超聲30 min基本已提取完全，故超聲時間選擇30 min。

3.5 小結(jié)

芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚均具有明確的藥理作用，屬六味地黃膠囊方中的重要有效成分。該試驗(yàn)建立了同時測定六味地黃膠囊中馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚3種成分含

量的反相高效液相色譜法（RPHPLC），結(jié)果表明，芍藥苷在0.066 5～1.663 2 μg、馬錢苷在0.107 9～2.697 7 μg、丹皮酚在0.122 4～3.060 0 μg范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.999 4、0.999 8、0.999 9，平均回收率分別為芍藥苷97.63%（RSD=0.82%）、馬錢苷97.66%（RSD=0.74%）、丹皮酚96.22%（RSD=1.21%）?？梢?，六味地黃膠囊樣品中丹皮酚的含量均符合中國藥典2010版不得低于規(guī)定0.3 mg/粒的規(guī)定[1]。這樣同時測定3個成分，能同時檢測六味地黃膠囊中牡丹皮和酒萸肉的含量，更加方便、快捷和具有代表性。同時該方法穩(wěn)定性和重復(fù)性好，可更科學(xué)、全面地用于六味地黃膠囊質(zhì)量控制和評價。

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