5種精油和多抗霉素對黃瓜枯萎病原菌抑菌活性的研究

潘彥彪　田永強　張阿強等

摘要 [目的]研究百里香等5種精油對黃瓜枯萎病原菌的抑菌效果，以及篩選出的優選精油和多抗霉素的協同抑菌效果。[方法]采用菌絲生長速率法篩選抑菌效果最強的精油，并檢測其最小抑菌濃度（MIC）和EC50，同時研究優選精油和多抗霉素的協同抑菌效果。[結果]精油中百里香的抑制效果最強，EC50為0.309 μl/ml，MIC為0.530 μl/ml。百里香精油和多抗霉素的協同抑菌效果明顯大于兩者的單一抑菌效果。[結論]試驗結果為天然藥物農藥的開發與利用提供了理論依據。

關鍵詞 黃瓜枯萎病；精油；百里香精油；多抗霉素；抑菌活性

中圖分類號 S436.421.1+3 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2015）15-117-04

Research on Antifungal Activities of Five Different Kinds of Essential Oil against Fusarium oxysporum.sp.cucumebrium Owen

PAN Yanbiao， TIAN Yongqiang*， ZHANG Aqiang et al

（School of Chemical and Biological Engineering， Lanzhou Jiaotong University， Lanzhou， Gansu 730070）

Abstract [Objective] To study the bacteriostasis effects on Fusarium oxysporum.sp.cucumebrium Owen which the five different kinds of essential oil have， such as thyme oil etc， and the coordination bacteriostasis effects of the selective preference essential oil and the polyoxin. [Method] Screening the essential oil which has the best bacteriostasis effect by growth rate method and check its MIC and EC50. A comparative study on the coordination bacteriostasis effects of essential oil and the polyoxin was conducted. [Result] The bacteriostasis effect of the thyme oil is the best among others. Its EC50 was 0.309 μl/ml and the MIC was 0.530 μl/ml. Obviously， the coordination bacteriostasis effect of the thyme oil and the polyoxin is better than any one of this two alone. [Conclusion] The study can provide theoretical basis for development and utilization of natural medicine pesticide.

Key words Fusarium oxysporum.sp.cucumebrium Owen； Essential oil； Thyme oil； Polyoxin； Antifungal activities

目前化學農藥殘留已成為危害人類健康的最大殺手之一，長期食用能誘發癌癥等多種疾病。天然藥物農藥被稱為綠色農藥，其種類的多樣性、抑菌的光譜性、對人體的超低危害性決定了其作為新一代農藥的優勢[1-5]。筆者采用菌絲生長速率法研究了5種精油對黃瓜枯萎病原菌的抑菌活性，測定了優選精油的MIC和EC50，并研究了該優選精油和多抗霉素的協同抑菌效果，旨在為天然藥物農藥的開發與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

試驗材料。百里香精油、桉葉精油、連翹精油、艾葉精油、薄荷精油、多抗霉素均購自化工有限公司；黃瓜枯萎病原菌，土豆，葡萄糖，瓊脂。

1.1.2 儀器。

LDZX50FA立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）、SWCJ2FD無菌操作臺（江蘇蘇州凈化設備有限公司）、MJ250I霉菌培養箱（上海一恒科技有限公司）、YP1002N電子天平（上海精密科學儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥物的配制。

1.2.1.1 精油使用液的配制。以無水乙醇和吐溫80溶解待測精油，無水乙醇用量為1 ml，吐溫80用量為10 μl，待測精油用量依據試驗情況而定。

1.2.1.2 多抗霉素使用液的配制。用無菌蒸餾水溶解多抗霉素得到濃度為0.1 g/ml的多抗霉素溶液，待測多抗霉素用量依據試驗情況而定。

用0.22 μm微孔濾膜對上述混合液抽濾除菌，現用現配。

1.2.2 抑菌率的測定。

1.2.2.1 藥物的初篩。使用菌絲生長速率法測定薄荷、連翹、桉葉、艾葉和百里香的抑菌活性。取5種精油使用液且精油用量相同，在無菌條件下加入250 ml已滅菌的三角瓶中，再加入99 ml已滅菌并冷卻到50 ℃左右的PDA培養基，充分搖勻后倒入4個培養皿，每個培養皿25 ml。以等量的乙醇-吐溫80混合液加入培養基為空白對照。以青枯立克為陽性對照，按照上述方法配制成2.0 μl/ml的含藥培養基。用10 mm打孔器在培養7 d的供試菌菌落邊緣打取長勢相同的菌餅，接入上述各平板中，每板中央各1枚，菌餅周圍要光滑，接菌餅時菌餅在培養基上如有滑動則該平板廢棄，菌餅有菌絲的一面朝下。放入28 ℃培養箱中培養，分別在 96、120和144 h后用十字交叉法測量菌落直徑，計算精油對菌絲的抑制率。首次篩選采用大幅度濃度梯度，再根據試驗結果縮小濃度范圍，直到待測精油中有1種或2種有明顯抑菌效果，而其他精油無明顯抑菌效果時的濃度為最終測試濃度[6-8]。

菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%

1.2.2.2 優選藥物不同濃度的抑菌活性測定。

通過“1.2.2.1”選取抑菌活性最強的精油，進行濃度梯度測定。配制精油使用液且精油含量分別為90、80、70、60、50、40、30、20和10 μl的濃度梯度。采用菌絲生長速率法測定，方法同“1.2.2.1”[9]。

1.2.2.3 不同濃度多抗霉素的抑菌活性測定。

配制多抗霉素使用液含量分別為10、20、50、100、200 mg的濃度梯度。采用菌絲生長速率法測定，方法同“1.2.2.1”[9]。

1.2.2.4 優選藥物和多抗霉素的協同抑菌效果。將優選精油和多抗霉素進行復配測試，方法同“1.2.2.1”[9]。

2 結果與分析

2.1 藥物的初篩 通過藥物初篩的濃度梯度測試，最終確定測試濃度為精油在含藥培養基中的濃度是1.0 μl/ml。

由表1和圖1可知，在1.0 μl/ml濃度下5種精油中連翹精油對黃瓜枯萎病原菌的抑制效果最差，并且表現出輕微的促進效果。桉葉的抑制率在10%左右，抑菌效果可以忽略。艾葉精油的抑制率明顯低于薄荷精油和百里香精油。薄荷精油96 h時的抑菌率高達9000%，但是在144 h時卻降到81.65%，明顯低于百里香精油連續3個檢測時間段的100%的抑制率。從整體來看，百里香精油的抑菌效果最好，薄荷精油次之，艾葉精油的抑菌效果不明顯，桉葉精油和連翹精油沒有抑菌效果。另外，桉葉、艾葉和薄荷精油的抑菌效果隨著時間的延長有下降趨勢，由于百里香精油在3個檢測時間段的抑菌效果都是100%，因此可以判斷百里香精油濃度為10 μl/ml時并不一定是對黃瓜枯萎病原菌毒性抑制的MIC，還需對百里香進行進一步的濃度梯度毒力檢測[10-11]。

2.2 優選藥物不同濃度的抑菌活性

根據表2數據計算出

百里香精油毒力方程為y=2.262 4x-0.199 3，r=0.985 8，百里香精油對黃瓜枯萎病原菌的EC50為0.309 μl/ml，MIC為0.530 μl/ml。由圖2可知，百里香精油濃度大于0.3 μl/ml時對黃瓜枯萎病原菌有明顯的抑制作用，且抑菌效果隨著時間的延長有下降趨勢，所測濃度梯度存在顯著性差異[12-14]。

2.3 抗生素多抗霉素不同濃度的抑菌活性

根據表3數據計算出多抗霉素毒力方程為y=0.051 9x+0.187 1，r=0.992 9，多抗霉素對黃瓜枯萎病原菌的EC50為6.029 0 mg/ml，MIC為15.662 8 mg/ml。由圖3可知，隨著時間的延長，抑菌效果有明顯的下降趨勢，所測濃度梯度的顯著性差異不明顯。

2.4 百里香和多抗霉素的協同抑菌活性

2.4.1 0.2 μl/ml百里香和不同濃度多抗霉素的協同抑菌活性。由表4和圖4可知，隨著時間的延長，百里香和多抗霉素的協同抑菌效果有下降趨勢。結合表3和圖3可知，在無百里香的情況下，多抗霉素各濃度梯度的抑菌效果無顯著性差異，而添加0.2 μl/ml百里香精油之后，各濃度梯度的抑菌效果有顯著性差異。

2.4.2 0.1 μl/ml百里香和不同濃度多抗霉素的協同抑菌活性。由表5和圖5可知，隨著時間的延長，百里香和多抗霉素的協同抑菌效果有下降趨勢。參照表3和圖3可知，在無百里香的情況下，多抗霉素各濃度梯度的抑菌效果無顯著性差異，而添加0.1 μl/ml百里香精油之后，各濃度梯度間存在顯著性差異。

注：不同大、小寫字母分別表示處理間在0.01、0.05水平差異顯著。

圖2 百里香不同濃度對黃瓜枯萎病原菌菌絲生長的抑制率變化趨勢

2.5 百里香同多抗霉素的協同抑菌效果和百里香、多抗霉素單一抑菌效果的對比

2.5.1 百里香同多抗霉素的協同抑菌效果和百里香、多抗霉素單一抑菌效果的對比（百里香濃度為0.2 μl/ml）。由表6和圖6可知，百里香同多抗霉素的協同抑菌效果和百里香、多抗霉素的單一抑菌效果相比，抑菌率大幅度增加。以96 h時百里香濃度為0.2 μl/ml、多抗霉素濃度為2.0 mg/ml為例，百里香和多抗霉素的抑菌率分別為35.06%和45.62%，而兩者的協同抑菌效果達到96.00%。同單一抑制

增加了15.32%，同樣，在添加了百里香的情況下協同效果較多抗霉素單一情況下增加了50.38%，比百里香單一抑菌效果（35.06%）增加了15.32%，充分體現出1+1﹥2的協同抑菌優勢。

2.5.2 百里香同多抗霉素的協同抑菌效果和百里香、多抗霉素單一抑菌效果的對比（百里香濃度為0.1 μl/ml）。由表7和圖7可知，百里香同多抗霉素的協同抑菌效果和百里香、多抗霉素的單一抑菌效果相比，抑菌率大幅度增加。

3 結論

5種精油對黃瓜枯萎病原菌抑菌效果大小為：百里香>薄荷>艾葉>桉葉>連翹。其中百里香抑菌效果最強，其各濃度間有顯著性差異，表明在所設濃度范圍內，濃度變化對菌絲生長影響較大。在百里香和多抗霉素的協同抑制中，兩者的混合抑制效果明顯大于各單一抑制效果，在百里香精油濃度為0.1 μl/ml時，百里香對黃瓜枯萎病原菌的抑制效果小于5%，已經沒有明顯抑制效果，但是在加入多抗霉素后，卻有著較明顯的抑制效果，與單一抑制效果相比，抑菌率有

了大幅度增加。

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