雜色鮑原代細胞培養方法的優化及其在基因功能研究中的應用

李敏　張麗莉　王國棟等

摘要 優化了雜色鮑原代細胞的培養條件，并利用原代細胞進行了RNAi和外源基因表達。結果表明，較高的滲透壓對血淋巴細胞培養起重要作用，淋巴細胞分離液分離血淋巴細胞更利于其生長。原代細胞培養至第5天，在細胞培養液中添加50 μg MyD88 dsRNA，能夠顯著降低MyD88 mRNA的表達。pEGFPN1轉染培養5 d的鰓細胞，5 d后可以檢測到綠色熒光。該研究表明可以成功培養雜色鮑血和鰓原代細胞，并且利用原代細胞可以進行功能基因表達量調低或調研究，為功能基因注釋提供了便利條件。

關鍵詞 雜色鮑；原代細胞培養；RNAi；轉染

中圖分類號 S917 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）15-146-05

Optimizing Primary Cell Culture Method of Haliotis diversicolor and Its Effect for Gene Function Study

LI Min1，2， ZHANG Lili1，2， WANG Guodong1，2* et al

（1. Fisheries College， Jimei University， Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea， Ministry of Agriculture， Xiamen， Fujian 361021； 2. Institute of Aquaculture Biotechnology， Jimei University， Xianmen， Fujian 361021）

Abstract The condition of primary cell culture was optimized in Haliotis diversicolor and these primary cells of hemocyte and gill were used in RNA interference （RNAi） and exogenous gene expression. Results suggested that hemocyte survived better in higher osmolarity of media， the way of using lymphocyte separation medium to culture hemocyte was beneficial for cell growth. MyD88 dsRNA were added to cell culture medium of hemocyte and gill after 5 days of culture which reduced the expression of MyD88. The plasmid pEGFPN1 was transfected into gill after 5 days of culture and the green fluorescence was detected 5 days later. Above all， the primary cell can survived in vitro and they are a proper tool for gene function analysis by regulating gene expression up or down， which provide convenient way for functional annotation.

Key words Haliotis diversicolor； Primary cell culture； RNAi； Transfection

雜色鮑是我國南方地區重要的水產養殖經濟物種之一。但是，隨著其養殖規模的擴大，爆發性病害日益嚴重，已成為雜色鮑養殖業重要的限制因素。雜色鮑疾病流行的原因眾多[1-3]，但其解決方案卻都需要雜色鮑免疫分子機制基礎資料的支撐。動物機體是一個完善自穩系統，由多種器官和組織構成，各有專職，但又相互配合影響。以整個動物機體為試驗材料進行免疫機制研究時，難以克服各個系統和組織之間的調控和反饋。由于影響因素眾多、試驗背景復雜，導致試驗數據分析困難，難以確切描述處理因素和生物機體響應之間的關系。細胞系因其細胞類型單一、功能一致，可以看作是單個細胞的放大，能夠避免上述問題，因此被認為更適合進行免疫功能基因的研究分析[4]。

體外細胞培養已成為研究復雜生命過程的重要手段之一，并在免疫學、病毒學和細胞工程等領域被廣泛運用。海洋無脊椎動物，特別是軟體動物的細胞培養至今都未取得良好的成果。由于缺少無脊椎動物細胞的生理生化知識，構建貝類細胞培養存在一系列難題[5-6]，比如共生微生物污染、不恰當的處理造成成體活力減弱、體外細胞增殖緩慢、培養基成分不確定、沒有合適的培養基質和蛋白水解酶損害細胞等。因此，目前唯一的軟體動物細胞系來源于胚胎的淡水蝸牛（Bromphalaria glabrat）的BGE[7]。此外，晏萌利用櫛孔扇貝（Chlamys farreri）的發育潛能較高的幼蟲進行原代培養，已經傳代到18代，并進行了細胞凍存[8]。由于構建細胞系存在多種困難，研究人員轉而投向軟體動物原代細胞培養。軟體動物的原代細胞作為重要的研究手段，在神經生物學、免疫學、毒理學、環境科學和功能基因組學等學科都作出了貢獻。

Bulloch認為神經元原代細胞培養可以準確反映神經元的消融和互補[9]，控制節奏的行為神經網絡識別和映射[10]。Le Pennec對歐洲大扇貝（Pecten maximus）培養的96 h的消化腺腺泡原代細胞進行FDA熒光法、MTT比色法和中性紅染色試驗，證明其在結構和功能上保持活性[11]。Parolini采用斑馬紋貽貝（Dreissena polymorpha）的血淋巴、鰓和消化腺原代細胞檢測阿替洛爾、卡馬西平、雙氯芬酸和菲諾貝特這4種化合物的毒性，臺盼藍排斥試驗表明鰓細胞和血細胞對這些藥物具有較高的靈敏度，可以用來進行生態毒理學研究[12]；AuzouxBordenave研究表明人的降鈣相關蛋白CGRP可以調節疣鮑（Haliotis tuberculata）原代外套膜和血淋巴細胞的活性，并且增加碳酸酐酶活性，這與活體結果研究一致，表明CGRPlike控制靶細胞生物礦化過程[13]。

筆者對雜色鮑的血淋巴、鰓和粘液腺進行原代細胞培養，并優化了細胞培養滲透壓和細胞分離方法，在獲得狀態良好原代細胞的基礎上進行了RNAi和外源基因表達質粒轉染試驗，旨在為研究貝類基因的功能提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物。

雜色鮑購自廈門培陽水產養殖有限公司，體重為（9.8±0.5）g，暫養于曝氣海水中，水溫約25 ℃，每天投喂新鮮海帶。

1.1.2 培養基。

以商品化DMEM/F12（Hyclone）為基礎培養基，添加不同濃度的胎牛血清（Hyclone）和飽和NaCl溶液（調節pH至7.2，121 ℃ 高壓滅菌20 min），并且添加1 %的雙抗（Hyclone）和0.25 μg/ml兩性霉素以及生長因子（0.5 ‰ β巰基乙醇、50 μg/ml N乙酰葡糖糖胺、50 μg/ml 羧甲基纖維素鈉、10 μg/L Human FGFbasic、5 μg/L Human EGF、1 μg/L Human HGF）。將制備的培養基于4 ℃下保存，使用時間不超過1個月。

1.2 方法

1.2.1 雜色鮑的前期處理。

選取活力好的雜色鮑，于過濾滅菌海水中培養2 h后，移入無菌操作臺中，置于一次性培養皿上，用移液槍吸取含雙抗的過濾滅菌海水反復沖洗雜色鮑腹足，并用滅菌紗布塊擦拭。

1.2.2 血細胞處理。

用一次性滅菌手術刀片割腹足中部，并滴加抗凝劑（0.15 g EDTA和0.1 g肝素鈉溶于10 ml稀釋10倍后的飽和NaCl溶液，過濾除菌）于傷口處，將500 μl血加入200 μl的抗凝劑中，混勻，4 ℃，2 000 g，離心5 min。小心棄去上清，輕輕吹打血細胞，移入培養瓶中，補加培養液至5 ml。或者根據索萊寶人淋巴細胞分離液試驗步驟，將500 μl血細胞加入200 μl的抗凝劑中輕輕顛倒混勻后，全部加到3 ml淋巴分離液中，2 000 g離心20 min。移去上層血清，加入培養液重懸細胞，轉移到培養瓶中。培養24 h后，觀察細胞形態。

1.2.3 鰓和粘液腺的處理。

用鑷子取出鰓和粘液腺，將整片鰓和粘液腺浸泡在滅菌含雙抗和兩性霉素的過濾海水中，每次5 min，重復5次（若有組織粘液，浸泡后將組織塊置于滅菌紗布塊上，吸去組織粘液）。用手術刀片將消毒后的鰓切成較小的組織塊，移入15 ml離心管中，加入2 ml胰酶消化5 min，吸除胰酶，加入3 ml培養液終止消化，吹打組織塊盡量使組織塊分散。將消化后的組織塊移入25 cm2的細胞培養皿中，組織塊均勻分布在培養瓶表面后，吸掉剩下的培養液，干貼倒置24 h后加入5 ml高鹽培養液正置培養。

1.2.4 轉染pEGFPN1質粒。

吸取過夜培養的菌液100 ml，按照全式金公司去內毒素質粒大提試劑盒步驟提取質粒。取穩定培養的血細胞和鰓，按照去除舊培養液，稀釋10倍的飽和氯化鈉溶液清洗1～2次，添加不含血清和雙抗的培養液。將10 μg 質粒稀釋于500 μl opti MEM（Gibco）中，輕輕混勻；然后將20 μl Sofast轉染試劑（梭華Sofast）稀釋于500 μl opti MEM中，輕輕混勻；將轉染試劑稀釋液滴加到質粒稀釋液中，邊滴加邊混勻。孵育20 min后，每孔添加100 μl的Sofast質粒復合物，輕輕搖動使其與培養液混合均勻。26 ℃，5% CO2培養48 h后，檢測熒光表達。

1.2.5 dsRNA合成。

將獲得的雜色鮑MyD88序列輸入到siDirect version 2.0（http：//sidirect2.rnai.jp/）中查找RNA 干擾靶位點，選取1段大小為573 bp（357～929 bp，登錄號為KF922374）的片段作為干擾序列，選取pEGFPN1中綠色熒光蛋白的1段大小為655 bp（741～1 395 bp）的片段作為陰性對照。將這2個序列分別克隆到pGEMT載體中，測序驗證序列的正確性。制備含T7的線性化DNA正向和反向片段，使用Promega膠回收試劑盒回收，根據T7 RiboMAXTM Express 步驟制備dsRNA，將合成的ssRNA均勻混合，70 ℃水浴10 min后緩慢冷卻至室溫形成dsRNA；加入DNase I 和Rnase A 37 ℃處理30 min后，分別取出DNA模板和單鏈RNA；加入0.1倍3 mol/L乙酸鈉和1倍異丙醇沉淀dsRNA，70%乙醇清洗2次后，稍微干燥加入適量水溶解dsRNA，電泳檢測其正確性，使用分光光度計檢測其OD值。

1.2.6 dsRNA 干擾方法。

血細胞和鰓細胞培養5 d后可進行干擾試驗。原代細胞中加入50 μg的MyD88 dsRNA作為試驗組，以50 μg EGFP dsRNA作為陰性對照，以50 μl PBS作為空白。每組實驗3個平行。處理24 h后，收集血細胞和鰓提取細胞的RNA。

2 結果與分析

2.1 原代細胞形態觀察及培養條件優化

原代血細胞在培養1 h內就可以貼壁（圖1A），此后3 d細胞增殖迅速（圖1B），此后進入停滯階段，大約7 d后細胞開始減少貼壁并脫落（圖1C）；原代鰓細胞加入培養液培養36 h后就有細胞從組織塊中遷移出來（圖1D），細胞多呈顆粒狀，較少有偽足，細胞大小比較均一，視野下不折射白光。并在此后數天可以持續增殖（圖1F），并且可以維持10 d；原代粘液腺細胞加入培養液后只有少數細胞遷移出來并貼壁，分為2種細胞，大型細胞和小型細胞形態差異大，大型細胞近似橢圓狀，小型細胞近似圓形。整體細胞數量較少，增殖不明顯（圖1G）。

在DMEM/F12 培養基的基礎上，研究添加不同濃度（10%、15% 和20%的胎牛血清）對原代細胞增值的影響。血、鰓和粘液腺等組織在不同濃度的血清中增殖無差異，所以試驗選擇濃度15%的胎牛血清。

比較320、750和1 100 mOsm/kg不同滲透壓對原代細胞增殖的影響，結果發現血、鰓和粘液腺等不同的組織可以在這3種滲透壓中生存。在320 mOsm/kg培養條件下，細胞能夠貼壁，但細胞狀態較差，血細胞形態大多為近似圓形，視野下折射出較強的白光下，細胞較小，多為近似圓形、空泡，視野下折射白光（圖2A），3 d后不再貼壁。在較高的滲透壓條件下，呈現出較為良好的狀態，細胞在1 h大多數細胞貼壁，形態飽滿，大小較為均一，細胞成不規則形狀，呈上皮樣，伸出多個偽足，形態不一，有三角型、Y型、梭型、圓形等。但是，在1 100 mOsm/kg的滲透壓下細胞貼壁情況更好（圖2B和C）。

研究不同接種方法對血細胞形態的影響，結果表明直接離心的方法對細胞損傷大，細胞貼壁能力下降，凝集現象比較嚴重，細胞大多呈現圓形，較少偽足伸出，培養基中細胞碎片多；采用淋巴分離液的方法對血細胞存活更有利。

2.2 MyD88 dsRNA對血細胞和鰓中MyD88表達的影響

將重組載體送交上海捷瑞生物工程有限公司驗證序列正確后，合成dsRNA。qPCR結果表明對培養5 d的血細胞以及培養5 d的鰓和粘液腺進行dsRNA干擾48 h后，半定量結果表明實驗組MyD88 的表達量顯著下降（圖3A），而EGFP組和未處理組沒有顯著差異；經檢測，血和鰓各組內參基因βactin基本沒有變化（圖3B）。

2.3 轉染pEGFPN1質粒

梭華-Sofast介導質粒轉染雜色鮑血淋巴和鰓原代細胞48 h后，置于熒光顯微鏡下檢測綠色熒光，起初4 d未檢測到熒光信號，直至第5天觀察到鰓細胞具有熒光（圖4），在不更換培養液的情況下熒光可以持續至第10天。血細胞狀態由上皮樣逐漸萎縮變圓至脫落，因此不能觀察到熒光，鰓細胞形態基本上沒有發生變化。

3 討論

3.1 培養基滲透壓的確定

培養基中的無機鹽有助于保持細胞的滲透平衡，陸地和淡水動物的滲透壓往往較低，商品化培養基的滲透壓也都是參照哺乳動物而設置的（人的生理鹽度是0.9%，滲透壓約為260～350 mOsm/kg），而大部分海洋動物的滲透壓較高[14-15]，所以需要調整海洋動物培養基的滲透壓。日本文昌魚（Branchiostoma belcheri）細胞培養發現表皮、鰓、內臟、卵巢可以在滲透壓為450～850 mOsm/kg中存活，但在750 mOsm/kg滲透壓條件下細胞形態最佳；培養日本對蝦（Penaeus japonicus）肝胰腺細胞的滲透壓為730 mOsm/kg時，細胞生長較好[16]；歐洲鮑螺（Haliotis tuberculata）的鰓細胞以及紫貽貝（Mytilus edulis）的消化腺和鰓報道的培養基滲透壓為1 100 mosm/kg [17-18]。該試驗中檢測不同滲透壓對血細胞形態的影響，發現較高滲透壓有利于細胞生長，細胞在形態和存活時間上都優于低滲透壓，這與其他海洋動物培養相似[6]，需要調節培養基的滲透壓至較高的濃度（大約是哺乳動物的2～3倍）才能維持正常的生理活動。

3.2 原代細胞的處理

仿刺參（Apostichopus japonicus）體腔細胞液細胞經離心重懸后再培養，發現細胞碎片增多，貼壁能力下降，推測其可能原因是離心后相互擠壓得非常結實，經吹打后貼壁能力下降[19]。利用淋巴細胞分離液成功對鯉魚、虹鱒魚對血液的淋巴細胞進行分離[20-21]；筆者所在實驗室也利用分離液對眼斑擬石首魚（Sciaenops ocellatus）的血液進行分離，并成功建立了細胞系，并進行核型分析（未報道）。筆者比較2種處理血淋巴細胞的不同方式對其生長的影響，結果表明直接離心的方法對細胞損傷大，可能是因為細胞在直接離心過程中細胞凝聚現象比較嚴重，重懸過程中造成細胞損傷，從而影響細胞貼壁及形態[19]。這是首次利用淋巴細胞分離液對軟體動物淋巴細胞進行培養，結果表明使用分離法對血細胞存活和形態更為有利。

對于鰓和粘液腺，都可以在滲透壓為1 100 mOsm/kg的培養基條件下生長。利用胰酶消化這2個組織，倒置干貼啟動原代培養。與其他組織培養不同，軟體動物的鰓和粘液腺都附著豐富的黏液，附生著大量的微生物[12，22]，所以在培養這類組織時就要采取嚴格的消毒措施，以防止細胞污染。在鰓和粘液腺進行除菌過程中，鰓需要在含高濃度抗生素的生理鹽水中漂洗多次。對于粘液腺上，還需要用紗布塊吸走粘液，這可能會對組織脫水，造成一定的損傷。倒置48 h后加入細胞培養液，粘液腺的組織塊在輕微晃動的情況下就會脫離細胞培養瓶瓶底，可能是因為粘液不能被完全除盡，造成組織游離在細胞培養瓶表面，只有很少細胞會貼在瓶底；鰓的組織塊貼壁比較穩固，且培養2 d后就能夠在組織塊附近發現有較多細胞遷移出來，且單個細胞貼壁穩固，并有增殖的現象。

3.3 MyD88 dsRNA對血細胞和鰓中MyD88表達的影響

目前，RNAi技術已經被廣泛運用到海洋無脊椎動物中，在太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）中注射ds HIFa導致 HIFa在外套膜、鰓和血淋巴中顯著降低[23]；You等使用RNAi技術干擾文蛤（Meretrix meretrix）原代消化腺細胞Ferritin基因，qPCR結果表明Ferritin基因的表達量與空白組相比下調了66.11%，WB結果表明蛋白水平下調了和20%[4]。該試驗中PCR結果表明成功干擾了血和鰓細胞MyD88 基因，使其在試驗組ds RNA組的表達量變低，而在對照組 EGFP ds RNA處理條件下其表達量與對照組基本上沒有差異。相對于活體，原代培養細胞為研究軟體動物基因功能的驗證提供了較好的選擇。

3.4 轉染pEGFPN1質粒

梭華-Sofast介導質粒轉染雜色鮑血淋巴和鰓原代細胞，結果發現轉染后血淋巴細胞形態變差。這可能是因為血細胞分化程度高，在體外培養條件下存活時間較短；轉染試劑可能對血細胞產生很大的毒性，造成細胞脫落。鰓細胞形態基本上沒有變化，并且在轉染后第5天可以見到熒光。鰓作為雜色鮑重要的呼吸器官在水中進行氣體交換，會經常接觸到有毒物質或者異物，其細胞具有較強的再生和修復能力[6，17，24]。這可能是鰓能夠被轉染而且可以在體外培養較長時間的原因之一。利用陽離子脂質體轉染試劑通常在48 h 左右就能夠檢測到熒光，但是鰓細胞需要在第5天才能夠檢測到，并且效率不高。究其原因，包括以下方面：①原代細胞不適合用于轉染；②鰓發揮其免疫功能，在一定程度上阻止轉染試劑DNA復合物進入細胞內；③培養液的高濃度離子對轉染造成影響；④需要利用轉染效率更高的方法，如病毒介導的轉染方法。

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