新疆尉犁縣3株荒漠微藻的重金屬抗性初步分析

祖路皮亞·載買爾　阿曼古力·海瓦爾　吾甫爾?米吉提

摘要 [目的]篩選出對重金屬抗性較好的微藻品系，給相關研究提供基礎試驗數據。[方法]利用光學顯微鏡和透射電鏡確定XLDB3、XLDB9、XLDB12 3株荒漠微藻品系的細胞形態。在實驗室條件下測定生長曲線，同時，測定不同濃度重金屬（Hg2+、Cd2+、Pb2+）和抗生素（氨芐青霉素、四環素、鏈霉素）對3株微藻品系生長的影響，并確定最佳抗性濃度。[結果]3株品系的細胞均為球形，XLDB3的細胞個體大，XLDB9和XLDB12的細胞壁很厚。3株品系的生長周期較長；它們對重金屬和抗生素均有一定的抗性，其中XLDB12對Hg2+和XLDB3對Pb2+的抗性最強，分別達到0.05和0.8 mmol/L，3株品系對Cd2+的抗性均達到0.05 mmol/L，對氨芐青霉素有很好的抗性，均達到1 000 μg/ml，XLDB3對四環素和鏈霉素的抗性最強，分別為60與40 μg/ml。[結論]該研究可為微藻和重金屬的相互作用研究及荒漠微藻的純化技術提供參考依據。

關鍵詞 荒漠微藻；重金屬抗性；抗生素抗性

中圖分類號 S181.3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）15-205-04

Preliminary Analysis of Heavy Metal Resistance of the Three Desert Microalgae in Yuli County of Xinjiang

ZULPIYE Zemir， AMANGVL Hewer， GHOPUR Mijit*

（College of Life Science and Technology， Xinjiang University， Urumqi， Xinjiang 830046）

Abstract [Objective] To select the microalgae strains which have better resistance to heavy metals， provide test data for correlational studies. [Method] OM and TEM were used to observe the cell morphology of XLDB3，XLDB9，XLDB12. The growth curve of three different microalgae under the laboratory conditions were measured. Different concentrations of heavy metals （Hg2+， Cd2+， Pb2+） added based on the growth condition. Antibiotics （Ampicillin， Tetracycline and Streptomycin） were employed to measure its tolerant ability in that adversity， and also the best resistance concentrations were determined. [Result] Three microalgae （XLDB3， XLDB9， XLDB12） cells were spherical， and XLDB3 cell was big ， XLDB9 and XLDB12 cell walls were very thick. Three strains of microalgae growth cycle were long. They have a certain amount of resistance to heavy metals and antibiotics； XLDB12 and XLDB3 have strongest resistance to have metal mercury and lead were found in this test respectively （0.05 mmol/L for Hg2+ ，0.8 mmol/L for Pb2+ ）. Three strains of microalgae have a same resistance to have metal cadmium was found （0.05 mmol/L for Cd2+）. Expressed remarkable adaptation potential to antibiotic， with the resistant rate of ampicillin up to 1 000 μg/ml， and XLDB3 have strongest resistance to Tetracycline and Streptomycin up to 60 and 40 μg/ml respectively . [Conclusion] The study can provide reference basis for interaction of microalgae and heavy metal， as well as purification technology of desert microalgae.

Key words Desert microalgae； Heavy metal resistance； Antibiotic resistance

藻類是環境中進化并完全適應于生存環境的，含有葉綠素和完成含氧的光合作用的大量并多種多樣的有機體。荒漠藻類是土壤藻（Soil Algae）的一個群體，主要是指生長在荒漠化地區上的微藻體[1]。藻類細胞壁分內外兩層，外層為由纖維素、果膠質、藻酸銨巖藻多糖和聚半乳糖硫酸酯等多層微纖絲組成的多孔結構，內層主要成分是纖維素。細胞壁上帶有一定電荷和粘性，增加了對重金屬離子的吸附能力。

目前，水污染已成為非常重要的環境問題。隨著經濟的迅猛發展和工業生產的加快，重金屬在化工、有色冶煉、電鍍、印染和農業等方面廣泛應用[2]，重金屬的污染也逐漸嚴重。從 2009 年至今，我國已經有 30 多起重特大重金屬污染事件，重金屬污染已經嚴重威脅到了我國人民的生活，重金屬污染必須引起我們的重視[3] 。過量的重金屬離子對生物體具有毒性作用，它們通過食物鏈進入動物體和人體內而引起各種疾病。這些污染物不僅直接傷害人類健康，破壞環境，而且還會給經濟造成嚴重損失。

傳統的重金屬水處理方法有化學沉淀法、離子交換法、電解化學法、蒸發濃縮法、膜技術和活性炭吸附工藝法等[4-5]。這些方法和技術具有效率高，時間短等優點，但是不適合大規模利用 [6]。因此，利用簡單而自然的原料和生物資源的生物吸附作用（例如細菌、真菌、酵母、藻類等）來處理是最佳選擇。與其他生物吸附劑相比，藻類具有較強的吸附性能，并且來源豐富。利用藻類治理重金屬污水已為眾多的研究證明具有高效，低耗，環保的特點[7]。在此基礎上探索藻類對重金屬廢水的生物吸附技術已逐漸成為國際水體污染處理研究中的一個新熱點。

在土壤微藻的分離純化過程中存在著大量的不同種類的細菌，這些細菌與藻類之間存在著密切的關系，它們既可能促進微藻的生長，也可能抑制其生長，因此藻與菌之間的關系一直是微藻研究重要課題之一。為了抑制細菌的生長而經常使用抗生素，所以研究土壤微藻對抗生素的抗性有其特定的生物學及實用意義。

該試驗研究了重金屬（Hg2+、Pb2+、Cd2+）和抗生素（氨芐青霉素、四環素、鏈霉素）對3株微藻品系生長的影響，并對3株微藻對重金屬和抗生素的抗性進行比較，以期為微藻和重金屬的相互作用研究及荒漠微藻的純化技術提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養

試驗所用的綠囊藻（XLDB3）、Marvania（XLDB12）和小球藻（XLDB9）是新疆大學植物生物技術校級重點實驗室植物細胞研究室從新疆富蘊縣荒漠樣本中分離純化而得到的。藻株的培養采用BBM培養基，培養條件為光強度為800～2 000 Lux，溫度為18～26 ℃，明暗周期為18 h∶8 h。在整個培養過程中，各操作步驟均進行滅菌處理（120 ℃，30 min）。

1.2 試驗試劑

HgCl2、CdCl2·2.5H2O、PbCl2為國產藥品，用雙重水定容至0.05 mol/L母液，存于容量瓶中備用。氨芐青霉素鈉鹽和四環素鹽酸鹽分別用雙重水定容至100和10 mg/ml標準溶液，鏈霉素硫酸鹽用無水乙醇定容至50 mg/ml的標準溶液，貯存-20 ℃備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 3種藻類生長的測定。取處于對數生長期的藻液，用血球計數板計數細胞并接種新配制的BBM液體培養基，接種量為4.7×104個/ml，每天人工搖1～2次。每天定時取樣測定650 nm波長下的吸光值。

1.3.2 3種藻類的細胞形態觀察。處于對數生長期的藻液取1 ml加入NaN3抑制細胞的運動，制備切片用OLYMPUS光學顯微鏡進行形態觀察。制備切片[8]利用透射電鏡觀察細胞的亞顯微結構。

1.3.3 3種藻類的抗重金屬特性檢測。已滅菌的BBM培養液中分別加入3種重金屬離子的母液（用針頭過濾器過濾），配制成的汞離子濃度分別為0.000 5、0.001 0、0.003 0、0.005 0、0.010 0 mmol/L，鉛離子的濃度分別為 0.3、0.4、05、0.6、0.8、1.0 mmol//L，鎘離子的濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mmol/L。以不加重金屬的空白組作為對照，3種藻株以4.7×104個/ml的接種量接入上述含不同濃度重金屬的培養液中進行培養，每個梯度3 個平行組，每天人工搖1～2次。每天定時取樣測定650 nm波長下的吸光值。

1.3.4 3種品系的抗生素抗性檢測。已滅菌的BBM培養液中分別加入3種抗生素，配成的氨芐青霉素濃度分別為40、45、50、55、60、100、250、500、1 000 μg/ml，四環素濃度分別為

2.5、5、10、20 30、40、45、50、55、60 μg/ml，鏈霉素濃度分別為1、2.5、5、10、20 30、40、45、50、55、60 μg/ml，以萊茵衣野生型

品系CC124作對照。4種藻株按4.7×104個/ml接種量接入含不同濃度抗生素的培養液中進行培養，每個梯度3 個平行組。每天人工搖1～2次，觀察細胞是否生長。

1.3.5 數據分析。

試驗所有數據用SPSS17.0軟件中的單因素方差分析進行分析。用Excel作圖。

2 結果

2.1 3種藻株的生長曲線

圖1表示了XLDB3、XLDB9、XLDB12 3株品系的生長情況。從圖1可知，3株品系在第4天開始進入對數生長期，在第10天由對數期末期轉入了衰亡期，整個生長過程中沒有出現穩定期，該3株品系的生長周期較長。

圖1 3種品系的生長曲線

2.2 3株品系的細胞結構

由圖2可知，品系XLDB3的細胞是球形，細胞體大；亞顯微結構很特殊，細胞的核區很明顯，核區周圍可以看出淀粉粒，細胞壁不厚，沒有發達的液泡。品系XLDB9的細胞是球形，與品系XLDB3相比，細胞體很小，細胞內有較大的液泡。該品系的細胞壁很厚，葉綠體很明顯，液泡系特別發達。品系XLDB12的細胞也是球形，與品系XLDB3相比，細胞體很小，細胞壁很厚，核區很明顯。

2.3 3株品系的重金屬抗性檢測

2.3.1 Hg2+對3株品系生長的影響。

由圖3可知，隨著時間的延長，3株微藻的吸光值不斷增加，但試驗濃度范圍內隨著（ Hg2+）的增加，吸光值不斷降低，6 d后更明顯（P<005）。藻株XLDB3和XLDB9在5種濃度組[ρ（Hg2+）≤0010 mmol/L]的吸光值與對照組相比差異顯著（P<005），高濃度組 [0.003 mmol/L≤ρ（Hg2+）≤0010 mmol/L] 的藻細胞生長幾乎停止，說明5種濃度的Hg2+抑制該2株品系的生長，ρ（Hg2+）≥0.005 mmol/L的Hg2+導致XLDB3的死亡，ρ（Hg2+）≥0.003 mmol/L的Hg2+導致XLDB9的死亡。藻株XLDB12低濃度組[ρ（Hg2+）≤0005 mmol/L]的吸光值與對照組相比差異不顯著（P>005）；高濃度組[ρ（Hg2+）=0.010 mmol/L]的藻細胞幾乎停止了生長，說明ρ（Hg2+）≤0050 mmol/L的Hg2+對該品系生長的抑制不明顯，XLDB12對0.050 mmol/L的Hg2+有抗性。XLDB12對金屬Hg2+的抗性高于XLDB3和XLDB9，XLDB12對Hg2+的抗性達到0.050 mmol/L。

43卷15期 祖路皮亞·載買爾等 新疆尉犁縣3株荒漠微藻的重金屬抗性初步分析

2.3.2 Pb2+對3種藻株生長的影響。

由圖4可知，Pb2+對3種微藻生長的影響與Hg2+不相同。XLDB3在5種濃度組[ρ（Pb2+）≤1.0 mmol/L]的吸光值與對照組相比差異不顯著（P>0.05），都高于對照組，4 d后高濃度組[ρ（Pb2+）=1.0 mmol/L]的吸光值不斷降低，藻細胞幾乎死亡，說明ρ（Pb2+）≤0.8 mmol/L的Pb2+促進XLDB3的生長，1.0 mmol/L 的Pb2+導致該品系的死亡，因此，XLDB3對Pb2+抗性達到0.8 mmol/L。前4 d內XLDB9和XLDB12在5種濃度組[ρ（Pb2+）≤1.0 mmol/L] 的吸光值與對照組相比差異不顯著（P>0.05），都高于對照組，4 d后XLDB9高濃度組[ρ（Pb2+）>0.4 mmol/L]的吸光值和XLDB12在5種濃度組[ρ（Pb2+）≤1.0 mmol/L] 的吸光值不斷降低（P<0.05），第6天藻細胞幾乎死亡，說明前4 d內5種濃度的Pb2+促進XLDB9和XLDB12的生長，4 d后0.3和0.4 mmol/L濃度下XLDB9的藻細胞仍然生長，其他濃度組的生長受到抑制，而XLDB12在5種濃度的生長都受強烈的抑制，最后都死亡。因此，XLDB9對Pb2+抗性達到0.4 mmol/L。XLDB3

2.3.3 Cd2+對3種藻株生長的影響。

由圖5可知，前4 d內XLDB3和XLDB12在5種濃度組的吸光值與對照組相比差異不顯著（P>0.05），4 d后該2株藻高濃度組[ρ（Cd2+）≥0.10 mmol/L]的吸光值不斷降低（P<0.05），第6天藻細胞幾乎死亡，說明前4 d內5種濃度的Cd2+對該2種品系生長的影響不明顯，4 d后高濃度組[ρ（Cd2+）≥0.10 mmol/L]的藻細胞生長受到抑制，到第6天細胞死亡，因此，XLDB3和XLDB12對Cd2+的抗性均達到0.05 mmol/L。在10 d內，XLDB9低濃度組[ρ（Cd2+）≤0.05 mmol/L]的吸光值與對照組相比差異不顯著（P>0.05），而高濃度組[ρ（Cd2+）≥010 mmol/L] 的吸光值與對照組相比差異顯著（P<0.05），第4天高濃度組[ρ（Cd2+）≥0.10 mmol/L]的藻細胞幾乎死亡，說明高濃度組的Cd2+強烈抑制該品系的生長，XLDB9對Cd2+的抗性也達到0.05 mmol/L。3株品系對Cd2+的抗性均達到0.05 mmol/L，其中XLDB3的抗性較強。

2.4 3株品系的抗生素抗性檢測

2.4.1 氨芐青霉素對4株品系生長的影響。

從表1可知，氨芐青霉素濃度為40～1 000 μg/ml時，4株品系都能正常生長，它們對氨芐青霉素的抗性均達到1 000 μg/ml，其中XLDB12的抗性最強。

2.4.2 四環素對4株品系生長的影響。

從表2可知，四環素濃度為2.5～60 μg/ml時，XLDB3和對照CC124在最高濃度中正常生長，而XLDB9和XLDB12能生長的最高濃度是40 μg/ml。因此，該4株品系中CC124對四環素的抗性較強，已達到60 μg/ml。

2.4.3 鏈霉素對4株品系生長的影響。

從表3可知，鏈霉素濃度為1～60 μg/ml時，對照CC124和XLDB3能生長的最高鏈霉素濃度為40 μg/ml，而XLDB9和XLDB12只能生長在1和2.5 μg/ml濃度中。該4株品系之中CC124對鏈霉素的抗性較強，已達到40 μg/ml。

3 結論與討論

通過該試驗可知，3株微藻對Hg2+和Pb2+的抗性存在較大的差別，它們對Hg2+的抗性大小順序為XLDB12>XLDB3>XLDB9，對Pb2+的抗性大小順序為XLDB3>XLDB9>XLDB12，對Cd2+的抗性基本一致。試驗中發現，氨芐青霉素對3株微藻品系和對照CC124的生長均沒有明顯的影響，當氨芐青霉素濃度在40～1 000 μg/ml之間變化時，4株品系均具有抗性，抗性大小順序為XLDB12> XLDB9> CC124> XLDB3。四環素對XLDB3和對照CC124生長的影響不明顯，該兩株品系對四環素均具有抗性，而四環素對XLDB9和XLDB12生長的影響較明顯，當濃度為2.5～40 μg/ml時，該2株微藻均有較弱的抗性，濃度到45 μg/ml時細胞就死亡，它們的抗性大小順序為CC124> XLDB3> XLDB12 > XLDB9。鏈霉素對4株品系生長的影響很明顯，當濃度為1～40 μg/ml時，XLDB3和CC124均有較強的抗性，濃度到45 μg/ml時細胞死亡，而鏈霉素濃度為5 μg/ml時，XLDB9和XLDB12都死亡，它們的抗性大小順序為CC124> XLDB3>XLDB9> XLDB12。

由于藻類細胞表面具有與重金屬離子結合的帶負電荷的官能團，使其在藻細胞的表面和內部沉積，因此，抑制藻類生長的主要原因被認為是重金屬離子與藻類的親和性，并且親和性越強毒性越大[9]。藻細胞可以有效降低重金屬離子對本身的脅迫作用，但隨著重金屬濃度的增加和脅迫時間的延長，微藻的正常生理功能受到嚴重傷害，從而逐漸喪失了對脅迫的調節能力[10]。

抗生素對藻細胞的作用是多方面的，抗生素對藻體本身有直接的作用，既可能抑制藻類的生長，又可能在特定濃度時刺激細胞內活性氧在低濃度范圍內的增多，從而促進微藻的生長。不同抗生素的作用機理是各不相同的。

參考文獻

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[10] 王帥，梁英，田傳遠.Cd2+脅迫對6株微藻生長及葉綠素熒光特性的影響[J].海洋湖沼通報，2009（3）：56-66.