固定化雙孢菇漆酶對萘酚綠B脫色的研究

夏文靜　李飛　周惠等

摘要 [目的]研究固定化雙孢菇漆酶對萘酚綠B的脫色效果。[方法]利用固定化的雙孢菇漆酶對萘酚綠B進行脫色，研究了溫度、萘酚綠B濃度、固定化漆酶用量、酸根離子以及金屬離子對脫色效果的影響。[結果]當脫色溫度為40 ℃，脫色時間為4 h，萘酚綠B濃度為60 mg/L時，脫色率可以達到96.6%。酸根離子中PO3-4、CO2-3、Cl-對脫色率有抑制效果，金屬離子中Cu2+、Mg2+對脫色率有促進效果，脫色率可以達到99.3%和97.6%。Fe2+對脫色率有抑制，脫色率是不添加金屬離子的27%。[結論]該研究可為萘酚綠B的脫色提供了一條新途徑。

關鍵詞 固定化漆酶；萘酚綠B；金屬離子；酸根離子；脫色率

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）15-220-02

The Decoloration of Naphthol Green B by Immobilized Laccase from Agaricus bisporus

XIA Wenjing， LI Fei， ZHOU Hui et al

（School of Biotechnology and Chemical Engineering， Taizhou College， Nanjing Normal University， Taizhou， Jiangsu 225300）

Abstract [Objective] The research aimed to study the decoloration effect of naphthol green B by immobilized laccase from Agaricus bisporus. [Method] Using the immobilized laccase from Agaricus bisporus to decolor naphthol green B， the effects of temperature， naphthol green B concentration， immobilized laccase usage， acidic group ion and metal ion on the decoloration were studied. [Result] When decoloration temperature was 40 ℃， and decoloration time was 4 h， and naphthol green B concentration was 60 mg/L， decoloration rate could reach 96.6%. In acidic group ions， PO3-4， CO2-3 and Cl- had inhibition effects on decoloration rate. In metal ions， Cu2+ and Mg2+ had promoting effect on decoloration， with decoloration rates of 99.3% and 97.6%， while Fe2+ had inhibition effect， which was 27% of decoloration rate not adding metal ions. [Conclusion] The research could provide a new channel for decoloration of naphthol green B.

Key words Immobilized laccase； Naphthol green B； Metal ion； Acidic group ion； Decoloration rate

目前，我國工業廢水對環境的污染十分嚴重，尤其是染料廢水的污染。每年產生的染料已經超過了7 000萬t[1-2] 。國內使用的大多染料穩定性好、耐光、耐微生物腐蝕，因此排放到環境中的染料廢水難被降解。漆酶能夠催化許多芳香族化合物并有廣泛的作用底物，具有很大的實際應用價值[3]。目前人們對漆酶的研究越來越多，漆酶成為環境保護用酶研究的熱點。筆者利用篩選的雙孢菇所產的漆酶對萘酚綠B進行脫色研究，為萘酚綠B的脫色提供了一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

漆酶：南京師范大學泰州學院微生物實驗室所產的杏鮑菇漆酶。

試劑：萘酚綠B、磷酸鈉、碳酸鈉、氯化鈉、硫酸鈉、硫酸銅、硫酸亞鐵、硫酸鋁、硫酸鎂、硫酸鉀、硫酸鈉（國藥）。

1.2 試驗方法

1.2.1 100 mg/L的萘酚綠B的配制。稱取0.01 g的萘酚綠B，用95%的乙醇溶解至10 ml，萘酚綠B的濃度為1 g/L，再用緩沖液檸檬酸鈉稀釋成100 mg/L的濃度。

1.2.2 不同濃度的萘酚綠B溶液的配制。不同濃度的萘酚綠B的配制見表1。

2 結果與分析

2.1 溫度對染料脫色效果的影響

取10 ml 100 mg/L的萘酚綠B，加入1 g固定化的小球，分別放置在25、30、35、45 ℃的條件下進行脫色，在0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0 h分別取樣，結果如圖1所示。由圖1可知，隨著溫度的升高。萘酚綠B的脫色率逐漸升高。當脫色溫度為40 ℃時，隨著時間的延長脫色率逐漸增大，當脫色時間為4 h時，脫色率達到872%，隨后隨著時間的延長，脫色率基本保持不變。綜合4個溫度對脫色的影響，確定最佳的脫色溫度為40 ℃，脫色時間為4 h。

2.2 萘酚綠B濃度對脫色效果的影響

取10 ml 不同濃度的萘酚綠B（20、40、60、80、100 mg/L），分別放入1 g固定化的小球，放在40 ℃的條件下保溫4 h，結果如圖2所示。由圖2可知，萘酚綠B濃度在20～60 mg/L的范圍內脫色率變化不大，維持在96%左右，此后隨著萘酚綠B濃度的增加，脫色率有所下降，當濃度為80 mg/L時，脫色率為90.2%，當濃度為100 mg/L時，脫色率為87.9%。

2.3 酶用量對萘酚綠B染料的脫色影響

稱取0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 g的小球分別放入到60 mg/L的10 ml染料中，在40 ℃的條件下保溫4 h，結果如圖3所示。由圖3可知，隨著小球用量的增加，脫色率不斷增大，當小球質量為100 g時，脫色率為96.5%，是小球用量為0.25 g時脫色率的1.61倍。此后隨著小球用量的增加，脫色率基本保持不變。

2.4 酸根離子對染料脫色的影響

在60 mg/L的萘酚綠B溶液中加入不同的酸根離子（PO3-4、CO2-3、Cl-、SO2-4）的鈉鹽，使酸根離子的終濃度為50 mmol/L，比較酸根離子對脫色率的影響。結果表明，SO2-4對萘酚綠B的脫色效果影響不大，其他酸根離子均有抑制作用。其原因是PO3-4、CO2-3、

Cl-破壞了酶與底物形成的復合物的離子鍵、氫鍵等的相互

作用力，從而也改變了漆酶的活性。

2.5 金屬離子對染料脫色的影響

酶是一種蛋白質，其催化效果受諸多因素的影響，其中，不同金屬離子對酶活力的影響不同[4]。漆酶是一種銅蛋白，每個漆酶蛋白分子含有4個銅離子，這4個銅離子在漆酶的氧化反應中起決定作用。金屬離子可能是酶的組成部分，也有可能是酶的激活劑或抑制劑。

該試驗在萘酚綠B的脫色反應體系中加入6種金屬離子（Cu2+、Fe2+、Al3+、Mg2+、K+、Na+）的硫酸鹽，并使金屬離子的終濃度為1 mmol/L，在40 ℃的條件下保溫4 h。結果表明，Cu2+ 、Mg2+對脫色率有促進作用，這是因為Cu2+ 、Mg2+是酶的激活劑[5]，Cu2+ 、Mg2+使酶的活力提升，從而提高脫色率。Fe2+對脫色率有抑制作用，這可能是因為Fe2+占據了底物與酶的結合位點，從而使酶活性受到了抑制作用[6]。

3 結論

筆者采用固定化的漆酶小球對萘酚綠B進行脫色，探討了溫度、濃度、固定化漆酶用量、酸根離子和金屬離子對萘酚綠B脫色的影響，在40 ℃的條件下，對60 mg/L的萘酚綠B脫色4 h，脫色率可以達到96.6%。筆者還對酸根離子和金屬離子進行研究，發現PO3-4、CO2-3、Cl-對脫色率都有不同程度的抑制作用，因此在進行萘酚綠B的脫色時，要注意選擇合適的溶液。此外還發現Cu2+和Mg2+對脫色有一定的促進作用，因為這兩種離子是酶的激活劑，Fe2+對脫色具有明顯的抑制效果，這是由于Fe2+競爭性地結合了酶的活性位點。

參考文獻

[1] AYED L，MAHDHI A，CHEREF A，et al.Decolorization and degradation of azo dye methyl red by an isolated Sphingomonas paucimobilis：Biotoxicity and metabolites characterization[J].Desalination，2011，274（1/3）：272-277.

[2] KADAM A A，TELKE A A，JAGTAP S S，et al.Decolorization of adsorbed textile dyes by developed consortium of Pseudomonas sp SUK1 and Aspergillus ochraceus NCIM1146 under solid state fermentation[J].Journal of Hazardous Materials，2011，189（1/2）：486-494.

[3] 鄭苗苗，焦戰戰，張令昂，等.紅平菇產漆酶條件優化及對孔雀綠染料脫色的研究[J].微生物學雜志，2014，34（4）：58-41.

[4] 李金花，程遠征，張洪林.纖維素降解過程中金屬離子作用的研究[J].臨沂師范學院學報，2005，27（3）：30-32.

[5] 周德慶.微生物學教程[M].北京：高等教育出版社，2002.

[6] 朱顯峰，丁濤.常見金屬離子對漆酶酶活的影響[J].化學研究，2003，14（3）：50-54.