北京油雞骨骼肌SV細胞成脂誘導分化的研究

宋嬌　楊燁　喻小瓊等

摘要

[目的]建立肌衛星細胞和肌內前體脂肪細胞的共培養體系。[方法]用10 μg/ml INS、1 μmol/L DEX和115 ng/ml IBMX對北京油雞肌肉SV細胞進行誘導后，通過油紅染色法、細胞免疫學鑒定及關鍵基因的表達對誘導的SV細胞進行分析。[結果]油紅O脂肪染色法鑒定結果表明，誘導后的細胞紅色脂質密度較高，說明SV細胞經過誘導后含有更多的前體脂肪細胞。通過實時熒光PCR定量檢測細胞發育的標志性基因，發現誘導與未誘導的肌肉SV細胞均會表達前體脂肪細胞標志性基因。[結論]肌肉SV細胞經過誘導后前體脂肪細胞的含量得到提高，有利于建立前體脂肪細胞和肌衛星細胞的體外培養體系。

關鍵詞 北京油雞；前體脂肪細胞；肌衛星細胞；共培養體系；誘導

中圖分類號 S831.8+9 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）15-151-03

Study on the Adipogenic Differentiation of SV Cells in Skeletal Muscles of Beijing You Chicken

SONG Jiao1， YANG Ye1*， YU Xiaoqiong2 et al

（1. College of Animal Science， Yangtze University， Jingzhou， Hubei 434025； 2. State Key Laboratory of Animal Nutrition， Institute of Animal Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193）

Abstract [Objective] This research aimed to establish the cocultures system of muscle satellite cells and intramuscular preadipocytes. [Method] The SV cells in the muscles of Beijing You Chicken were induced with 10 μg/ml insulin （INS）， 1 μmol/L dexamethasone （DEX） and 115 ng/ml 3isobutyl1methyl xanthine （IBMX）. And the induced SV cells were identified by oil red O staining， cellular immunological identification and the expression of key genes involved in adipogenesis and myogenesis. [Result] The results of oil red O staining showed that the induced SV cells contained higherdensity red stained lipid， which indicated that the induced SV cells contained more preadipocytes. The key genes about the cell development were detected by realtime fluorescent quantitive PCR. The detection results showed that the key genes of preadipocytes could be expressed by induced and noninduced SV cells in the muscles. [Conclusion] The induced muscle SV cells contained more preadipocytes， which was be propitious to establish the coculture system in vitro of muscle satellite cells and preadipocytes.

Key words Beijing You Chicken； Preadipocyte； Muscle satellite cell； Coculture system； Induction

肌內前體脂肪是肌衛星細胞的重要組成部分之一，肌衛星細胞在特定的分子機制（如PPARs信號系統、WNT信號系統和肌肉分泌因子）作用下可以轉變為脂肪細胞[1]。由于受到肌肉和脂肪內分泌素（myokines、adipokines）相互作用的影響，肌內脂肪細胞可能與脂肪組織里脂肪細胞具有不同的生物學代謝過程[2]。在共培養體系中，肌細胞和脂肪細胞的代謝都與單獨培養時的代謝具有一定的差異[3]。因此，建立合適的共培養體系能更好地闡明細胞間相互聯系的復雜性，是研究肌內脂肪沉積和肌肉發育的生物學基礎。

來源于肌肉的SV細胞具有類似于肌衛星細胞的增殖分化特性，同時也具有一些脂肪細胞的特性，是一種建立理想細胞共培養體系的細胞來源，但由于受到細胞貼壁時間的影響，在分離的肌肉SV細胞內含有的前體脂肪細胞很少[4]，同時受到肌細胞分泌素（myokines）的影響，前體脂肪細胞的分化會受到嚴重抑制[5]?；诖?，筆者在前期分離肌肉SV細胞的基礎上，使用一定的脂肪生成誘導劑對肌肉SV細胞的脂肪生成能力進行誘導，以使肌肉SV細胞中的前體脂肪細胞更好地分化表達，從而建立一種理想的細胞培養模型。

1 材料與方法

1.1 試劑

DMEM、DMEM/F12、胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）均為Gibco公司產品；Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、地塞米松（Dex）、胰島素（Ins）、3異丁基1甲基黃嘌呤（IBMX）均為Sigma公司產品。Pax7鼠抗雞一抗、Demsin鼠抗雞一抗、FITC羊抗鼠二抗均為Abcam公司產品。

1.2 肌肉基質細胞的分離與培養

采用窒息法將4～7日齡北京油雞殺死后，放入75%（v/v）酒精溶液中全身浸泡消毒30 s，于細胞室超菌臺進行分離細胞工作。取胸大肌后迅速放入含有雙抗的DHanks溶液中清洗3次，剪成肉糜狀，移入10 ml離心管中，再加入2倍體積的0.1%Ⅰ型膠原蛋白酶，于37 ℃搖床中消化30～40 min，1 000 r/min離心8 min，棄上清。然后，再加2倍體積的0.25%的胰蛋白酶，37 ℃搖床中消化15～20 min；此后，加入2～3倍體積的DMEM培養基中止消化，用吸管反復吹打使組織分散，將細胞懸浮液依次濾過200、400和600目的不銹鋼篩，收集濾液。將過濾液1 000 r/min離心5 min，棄上清，用2 ml含15%FBS的DMEM重懸細胞，接種于培養板在37 ℃、5%CO2培養箱中培養2 h后，將細胞懸浮液接種于其他培養板，獲得肌肉SV細胞。

1.3 肌肉SV細胞成脂誘導后脂質含量的測定

分離細胞按1×105個/ml接種于6板96孔板，每孔接種100 μl，每板接種18孔，其中誘導和未誘導各9孔，誘導組在細胞貼壁后使用含有10 μg/ml INS、1 μmol/L DEX和115 ng/ml IBMX的培養液誘導分化，在誘導24、48、72 h后進行細胞脂質含量。其中3板分別在誘導24、48、72 h后采用油紅O染色法測定細胞內脂質含量，另外3板在上述時間采用MTT法測定細胞數量。以單位細胞數的OD值反映細胞內脂質含量。

1.4 肌肉SV細胞成脂誘導后細胞的鑒定

將分離的基質細胞按1×105個/ml接種于6孔板，每孔2 ml，當細胞生長至70%～80%匯合時，細胞分為未誘導組（對照組）和誘導組，誘導組使用含有10 μg/ml INS、1 μmol/LDEX和115 ng/ml IBMX的培養液誘導分化，在誘導48 h后2個處理同時采用油紅O染色法進行前體脂肪細胞的鑒定。

1.5 肌肉SV細胞成脂誘導后基因表達的測定

將分離到的基質細胞按1×105個/ml接種于6孔板，每孔2 ml，當細胞生長培養6 d后，將細胞分為未誘導組（對照組）和誘導組，誘導組使用含有10 μg/ml INS、1 μmol/L DEX和115 ng/ml IBMX的培養液誘導分化，在誘導24、48 h后分別收集2組的細胞，提取細胞RNA，每個時間點提取6孔（6個重復），對肌衛星細胞特異性基因（Pax7、MyoD、Myogenin）和脂肪細胞發育特異性基因（C/EBPβ、SREBP2、PPARγ、LPL）的mRNA表達進行分析?；蛞锛靶蛄刑栆姳?。通過2 -ΔΔCt 值來衡量誘導對基因相對表達量的影響[6]。

1.6 數據統計與分析

采用SAS 8.0統計軟件中的ANOVA程序對不同誘導時間細胞的基因相對表達量的差異進行分析，差異顯著者采用Duncan氏法進行多重比較。試驗結果以平均值±標準誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 肌肉SV細胞脂質含量 從圖1可以看出，隨著培養時間的增加，肌肉SV細胞脂質的含量逐漸增加，并且隨著誘導時間的增加，脂質含量明顯增加。

2.2 細胞的鑒定 前體脂肪細胞油紅O染色結果表明，誘導組和未誘導組細胞都有紅色脂質沉積，其中誘導后的細胞紅色脂質密度較高（圖2），說明誘導有助于前體脂肪細胞的分化。

2.3 細胞關鍵基因表達的分析

從圖3可以看出，前體脂肪細胞在誘導24 h后C/EBPβ和LPL基因的表達水平顯著

下降（P<0.05），而誘導48 h后又顯著上升（P<0.05）；

3 討論

肌肉SV細胞中含有豐富的前體脂肪細胞和肌衛星細胞，是建立前體脂肪細胞和肌衛星細胞共培養體系理想的細胞來源[4]。由于這2種細胞貼壁時間的不同，從肌肉SV細胞分離到的肌衛星細胞中含有的前體脂肪細胞數量很少，肌衛星細胞在數量上占有絕對優勢，但肌衛星細胞作為具有多種自我更新的異質干細胞群，同時也具有肌衛星細胞具有轉化為脂肪細胞的潛力，在特定細胞因子的作用下（如PPARs、WNT生長因子、myokines等），肌衛星細胞可以轉化為脂肪細胞并沉積脂肪，同時伴隨著脂肪細胞特異性基因（如PPARγ）的表達[1]。

在多細胞培養體系中，DEX（地塞米松）和胰島素（INS）一般都用于促進脂肪細胞的分化和脂肪的形成[7]。前體脂肪細胞在激素（胰島素和類固醇激素）的作用下啟動C/EBPβ和C/EBPδ的表達，從而促進一系列脂肪形成轉錄因子的表達[8]。C/EBPβ和C/EBPδ是脂肪形成早期表達的主要轉錄因子，通過C/EBPβ和C/EBPδ的協同作用可以促進PPARγ的表達[9]。甾醇調節元件結合蛋白（SREBP）是前體脂肪細胞向脂肪細胞分化的標志，SREBP在體內通過PPARγ途徑調節許多與脂肪生成有關的基因的表達，如LPL和FAS等。PPARγ是脂肪開始生成轉錄的標志性蛋白，是脂肪形成所必需的轉錄因子[8]。SV細胞在激素誘導下，PPARγ、C/EBPβ和SREBP的表達量都會增加，說明SV細胞

中前體脂肪細胞的數量發生了變化，并隨著誘導時間的增

加，基因的表達會有所增加。

肌肉內脂肪的代謝途徑是肌內脂肪細胞和肌細胞相互作用的結果，肌內脂肪與肌肉的比例不僅是評價動物肉品質非常重要的指標，也是影響動物健康的重要因素[1]。因此，建立合適的肌細胞和肌內脂肪細胞共培養的模型，不僅可以

研究肌內脂肪的沉積和肌細胞發育機制，從而改善動物肌肉

品質，更重要的是可以研究二者的相互調控對動物健康的影響，促進動物福利的改善。該研究只提供了這2種細胞共培養的初步模型，今后還需要對這2種細胞的精確調控發育進行進一步研究。

參考文獻

[1] VETTOR R，MILAN G，FRANZIN C，et al.The origin of intermuscular adipose tissue and its pathophysiological implications[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2009，297：987-998.

[2] SELL H，DIETZESCHROEDER D，ECKEL J.The adipocytemyocyte axis in insulin resistance[J].TRENDS in Endocrinology and Metabolism，2006，17（10）：416-422.

[3] VU V，KIM W，FANG X，et al.Coculture with primary visceral rat adipocytes from control but not streptozotocininduced diabetic animals increases glucose uptake in rat skeletal muscle cells：Role of adiponectin[J].Endocrinology，2007，148：4411-4419.

[4] HAUSMAN G J，POULOS S P.A method to establish cocultures of myotubes and preadipocytes from collagenase digested neonatal pig semitendinosus muscles[J].J Anim Sci，2005，83：1010-1016.

[5] QUINN L S，ANDERSON B G，STRAITBODEY L，et al.Oversecretion of interleukin15 from skeletal muscle reduces adiposity[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2009，296：191-202.

[6] LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2 -ΔΔCT method[J].Methods，2001，25：402-408.

[7] POULOS S P，DODSON M V，HOUSMAN G J.Cell line models for differentiation：preadipocytes and adipocytes[J].Experimental Biology and Medicine，2010，235：1185-1193.

[8] TONTONOZ1 P，SPIEGELMAN B M.Fat and beyond：The diverse biology of PPARγ[J].Annu Rev Biochem，2008，77：289-312.

[9] LEFTEROVA M I，LAZAR MA.New developments in adipogenesis[J].Trends Endocrinol Metab，2009，20：107-114.