蝦蛄多肽酶解工藝的優化及其體外免疫活性研究

卜天　馬劍茵

摘要[目的] 研究蝦蛄多肽的免疫活性。[方法] 采用胰蛋白酶水解蝦蛄的生物組織，通過單因素試驗和正交試驗探索其最佳酶解條件，采用MTT試驗研究蝦蛄多肽對小鼠巨噬細胞的細胞活性，并通過中性紅吞噬試驗分析蝦蛄多肽的免疫調節能力。[結果] 蝦蛄多肽的最佳酶解條件為：溫度62.5 ℃、pH 9.5、酶解時間8 h、加酶量0.08%，此時蝦蛄多肽對RAW264.7有最高的細胞活性，并對小鼠巨噬細胞的吞噬能力表現出一定的促進作用。[結論] 該研究為從海洋蛋白中獲取高生物活性的酶解產物和具有免疫活性的多肽提供了一定的科學依據。

關鍵詞蝦蛄多肽；胰蛋白酶；酶解條件；免疫活性

中圖分類號S917文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）07-139-02

蝦蛄（Oratosquilla oratoria）隸屬節肢動物門[1]、甲殼綱、軟甲亞綱、口足目、蝦蛄科口蝦蛄屬，又名皮皮蝦、東方蝦蛄、富貴蝦、瀨尿蝦等，廣泛分布在我國、日本以及東南亞的沿海地區。我國南北沿海等地均有大量生產。蝦蛄肉質鮮美，營養豐富，物美價廉，深受消費者喜愛。從海洋生物中提取到的多肽，其功能活性主要集中在抗菌、抗氧化、免疫調節、抑制胰島細胞凋亡及改善胰島素抵抗、降血壓、降血脂、增強骨質強度及預防骨質疏松、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖及抗血管生成等方面[2-5]。目前，關于蝦蛄藥用價值的研究有口蝦蛄乙酸乙酯提取物與阿霉素或順鉑聯合作用對人肝癌HepG2細胞的增殖抑制[6]，口蝦蛄提取物對人低分化鼻咽癌細胞株CNE-2的遷移及體外血管生成擬態的抑制作用[7]等。有關蝦蛄的研究中大多是提取其酶解液進行腫瘤抑制試驗，然而關于蝦蛄酶解液對免疫細胞作用的研究還不多。筆者采用蝦蛄為原料，用胰蛋白酶作為水解酶，以小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞活性作為多肽活性指標，采用正交試驗方法探討其最佳酶解條件，提取多肽，同時通過小鼠巨噬細胞中性紅吞噬試驗探索蝦蛄多肽的免疫活性。

1材料與方法

1.1原料與試劑

新鮮蝦蛄采集自浙江省舟山市附近海域；胰蛋白酶（購自國藥集團化學試劑有限公司）；氫氧化鈉，購自無錫市晶科化工有限公司，分析純；鹽酸（36%～38%），購自國藥集團化學試劑有限公司，優級純；二甲基亞砜（DMSO）、MTT試劑、中性紅試劑，均購自美國Sigma公司。

1.2儀器

DS-1高速組織搗碎機，為上海標本模型廠產品；BS110電子分析天平，為北京賽多利斯天平有限公司產品；PHS-250精密pH計，為上海精密科學儀器有限公司產品；SSW-420-2S恒溫水浴鍋，為上海一恒科學儀器有限公司產品；LGJ-18冷凍干燥機，北京松源華興科技發展有限公司產品；CF16RXⅡ高速冷凍離心機，日本日立公司產品。

1.3試驗方法

1.3.1

MTT法檢測蝦蛄多肽對細胞活性的影響。取對數生長期的小鼠巨噬細胞制成細胞懸液，接種至96孔板，每孔200 μl，設置5個平行孔，于5% CO2、37 ℃條件下貼壁12 h，置于倒置顯微鏡下觀察，并棄去培養液，同時將蝦蛄酶解液凍干粉以10 mg/ml溶于培養液中。然后分別加入每個孔，同時設置不加樣品的空白對照組，置于5% CO2、37 ℃培養箱中孵育24 h，加入含有MTT的培養液，繼續培養4 h。終止培養，離心并去除上清液。每孔加入二甲基亞砜100 μl，并置于搖床上低速振蕩15 min，采用酶聯免疫檢測儀于波長570 nm處測定各孔的吸光值（A值），以A值大小表示小鼠巨噬細胞代謝活性的強弱[8]。

1.3.2

單因素試驗探索酶解工藝條件。用高速組織搗碎機將蝦蛄組織搗碎勻漿，用緩沖液調pH，加入胰蛋白酶酶解數小時，100 ℃下滅酶15 min，于4 ℃下離心15 min（10 000 r/min）并取上清液，采用MTT法測定酶解液對小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞活性的影響。采用單因素試驗分析酶解溫度、pH、時間及加酶量對細胞活性的影響，并初步確定酶解法制備蝦蛄多肽的工藝條件。

1.3.3

酶解蝦蛄多肽工藝的優化。在單因素試驗的基礎上，運用正交設計試驗優化酶解工藝條件，并采用MTT法測測小鼠巨噬細胞活性。

1.3.4

中性紅法檢測蝦蛄多肽免疫調節活性。

取對數生長期的小鼠巨噬細胞RAW264.7制成濃度為106個/cell的細胞懸液，接種至96孔板，每孔200 μl，設5個平行孔，于5% CO2、37 ℃條件下貼壁3 h，倒置顯微鏡下觀察，棄去培養液，同時將上述最佳酶解條件下制備的蝦蛄酶解液以梯度濃度分別溶于培養液中，每孔150 μl。另外，設置不加樣品的空白對照組和加入LPS（1 mg/L）擬細胞炎癥反應的陽性對照組。置于5% CO2、37 ℃培養箱中孵育48 h，每孔再加入0.1%中性紅溶液50 μl，繼續培養3 h，終止培養后離心并吸棄上清液，用 PBS 洗滌 3 次，每孔加入 100 μl 細胞裂解液（乙酸∶無水乙醇=50∶50），4 ℃下靜置過夜，使用酶標儀于540 nm處測定吸光度A值。以A值大小表示巨噬細胞吞噬功能的強弱[9-10]。以試驗組A值與空白組A值的比值表示蝦蛄多肽作用下對巨噬細胞吞噬能力的促進率，按照以下公式進行計算：

促進率=A試驗組/A空白組×100%。

2結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1

溫度對蝦蛄酶解產物的影響。從圖1可以看出，隨著酶解溫度的增加，小鼠巨噬細胞細胞活性（A值）不斷增加，當酶解溫度為60 ℃時A值達到最大值。

圖1 酶解溫度對小鼠巨噬細胞活性的影響

2.1.2

pH對蝦蛄酶解產物的影響。從圖2可以看出，隨著pH的升高，小鼠巨噬細胞活性不斷增加，并在pH為10時達到最大值，此后開始降低。

圖2酶解pH對小鼠巨噬細胞活性的影響

2.1.3

酶解時間對蝦蛄酶解產物的影響。從圖3可以看出，小鼠巨噬細胞活性（A值）隨著酶解時間的增長而升高，當酶解8 h后A值最大，此后A值隨著酶解時間的增長而降低。

圖3酶解時間對小鼠巨噬細胞活性的影響

2.1.4

加酶量對蝦蛄酶解產物的影響。從圖4可以看出，隨著加酶量的增長，小鼠巨噬細胞（A值）不斷降低，當加酶量為0.12%時（A值）最大。

圖4加酶量對小鼠巨噬細胞活性的影響

2.2正交試驗優化酶解工藝條件

由表5可知，各因素對胰蛋白酶酶解蝦蛄的影響程度依次為溫度>加酶量>pH>時間。溫度是優化條件中影響最大的因素，加酶量次之，而時間的影響最小。最佳酶解工藝條件為：酶解溫度62.5 ℃，pH為9.5，酶解時間8 h，加酶量為0.08%。

表5酶解正交試驗設計及結果

序號時間pH溫度加酶量吸光值

11（7.5 h）1（9.5）1（57.5 ℃）1（0.08%）1.784

212（20）2（60 ℃）2（0.12%）2.114

313（10.5）3（62.5 ℃）3（0.16%）1.323

42（8 h）1232.344

522312.793

623111.512

73（8.5 h）1322.432

832131.602

933212.245

X11.7402.1871.6332.274

X22.2162.1702.2342.019

X32.0931.6932.2831.756

極差0.4760.4940.6010.518

2.3中性紅吞噬試驗結果

由表1可知，隨著蝦蛄多肽濃度的升高，陽性對照組及部分試驗組的吸光度顯著升高（P<0.05），小鼠巨噬細胞的吞噬能力逐漸增強，說明蝦蛄多肽具有一定的免疫調節能力，但其增強作用低于陽性對照，即不會引起細胞炎癥反應。

表1小鼠巨噬細胞RAW264.7中性紅吞噬試驗結果（x±S，n=5）

組別濃度∥mg/ml吸光值促進率∥%

空白0.092±0.004-

陽性對照（LPS）0.142±0.015*154

150.099±0.018107

2100.107±0.013116

3150.110±0.004119

4200.116±0.010*126

5250.115±0.008*125

注：*表示與空白對照組相比差異顯著（P<0.05）。

3討論

蝦蛄生長于海洋世界，其多肽的氨基酸結構和組成均有其特殊性，為從海洋生物多肽酶解液中獲得較高生物活性的多肽提供了可能性。筆者采用組織勻漿、酶解、冷凍離心等方法提取蝦蛄活性多肽，中性紅吞噬試驗結果表明蝦蛄經過酶解后具有一定的免疫活性。

筆者采用胰蛋白酶對蝦蛄進行酶解，并對影響多肽酶解過程的各個因素及水平進行綜合分析，酶解最佳條件為酶解溫度62.5 ℃，pH為9.5，酶解時間8 h，加酶量0.08%。通過MTT試驗和小鼠巨噬細胞中性紅吞噬試驗探索了蝦蛄多肽的細胞活性與免疫活性，試驗結果為更好地使用酶解從海洋蛋白中獲取高生物活性的產物和具有免疫活性的多肽提供了一定的科學依據，其免疫活性及其機制還有待于深入研究。

參考文獻

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