BTLA與HVEM相互作用對T細胞活化的影響

王蕓蕓，蔣玉平，張標，顧宗江

（1.蘇州大學基礎醫學與生物科學學院免疫學系，江蘇蘇州215007；2.鹽城市產品質量監督檢驗所，江蘇鹽城224005）

BTLA與HVEM相互作用對T細胞活化的影響

王蕓蕓1，蔣玉平2，張標1，顧宗江1

（1.蘇州大學基礎醫學與生物科學學院免疫學系，江蘇蘇州215007；2.鹽城市產品質量監督檢驗所，江蘇鹽城224005）

目的：探討小鼠髓系樹突狀細胞（BMDC）上HVEM與T細胞上BTLA相互作用對T細胞活化的影響。方法：C57BL/6小鼠的BMDC與T細胞混合培養，HVEM抗體封閉BMDC上的HVEM后，采用MTT法檢測T細胞的活化增殖，ELISA試劑盒檢測IL-2的分泌。結果：混合培養的啟動和早期（0～48 h）、中晚期（48～96 h）以及全程（0～96 h），加入HVEM抗體實驗組的T細胞增殖效應均明顯高于對照組（P＜0.05），同時CD3+T細胞組和CD4+T細胞組IL-2的分泌明顯高于對照組（P＜0.05）。結論：BTLA-HVEM相互作用產生的負性信號對T細胞的活化起抑制作用，特別是在BMDC與T細胞混合培養的啟動和早期（0～48 h），BTLA負性信號就有抑制T細胞活化的作用，有別于傳統的負反饋調節抑制，提示T細胞的活化可能存在多種負性調節模式。

BTLA；T細胞；免疫調節

BTLA（B and T lymphocyte attenuator）是進行基因篩選時，在T細胞上發現的第3個負性共分子，屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，相對分子質量為34.5×103，具有免疫球蛋白可變區（IgV）樣結構域的胞外段、跨膜區和100個氨基酸組成的胞內段。其中胞內段具有3個重要的含酪氨酸殘基的基序，分別為Grb2結合基序、免疫受體酪氨酸抑制基序和免疫受體酪氨酸轉化基序，表明BTLA具有與CTLA和PD-1相似的結構［1-4］。最初推測B7x可能是BTLA的配體，然而缺乏兩者結合的直接證據。以后研究證實，TNF受體超家族成員HVEM（herpesvirus entrymediator）是BTLA的配體。HVEM與BTLA結合，可以誘導BTLA胞內酪氨酸磷酸化，進而招募磷酸酶SHP-1和SHP-2，抑制T細胞的活化［5-9］。HVEM作為受體又可結合TNF超家族成員LIGHT，傳遞促進T細胞活化的正向信號［10-12］。BTLA、HVEM和LIGHT表達在多種免疫細胞上，同時又受到細胞活化狀態的調節［13-14］。這種復雜的表達方式和正負信號交織使得T細胞的免疫應答受到更精確的調節。因此，對BTLA在T細胞上的負性調節作用的研究具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

抗小鼠HVEM多抗、rmGM-CSF和rm IL-4（R&D公司）；RPMI 1640培養基（Gibco公司）；胎牛血清（FCS，杭州四季青公司）；CD11c-FITC抗體（eBioscience公司）；淋巴細胞分離液（Ficoll，上海生化試劑二廠）；CD11c、CD3、CD4和CD8小鼠陽性磁珠分選試劑盒（Stemcell公司）；流式細胞儀（Altra，Beckman-Coulter公司）；全自動酶標儀（Bio-Rad公司）。6～8周齡的C57BL/6小鼠購自中國科學院上海實驗動物中心，由蘇州大學動物實驗中心飼養。

1.2 方法

1.2.1 小鼠髓系樹突狀細胞（BMDC）的誘導及純化 無菌取6～8周C57BL/6小鼠骨髓細胞，經Tris-NH4Cl低滲溶解紅細胞，PBS洗滌2遍后調整細胞密度至5×105/mL，于含10 ng/mL rmGM-CSF和4 ng/mL rm IL-4的RPMI 1640完全培養基（含10%胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素）的24孔培養板中培養，培養第3天半量換液，再培養2～3 d，收集非貼壁細胞，用CD11c-FITC抗體標記后進行流式細胞儀檢測，然后按照磁珠分選試劑盒的說明，以CD11c陽性分選磁珠進行分選并獲取BMDC，簡稱DC。

1.2.2 小鼠脾臟T細胞的獲取與純化 無菌取6～8周C57BL/6小鼠脾臟，使用5 mL注射器沖洗出脾臟細胞，PBS洗2遍。Tris-NH4Cl低滲溶解紅細胞后，用Ficoll分離出淋巴細胞，按照磁珠分選試劑盒的說明，分別以CD3、CD4和CD8磁珠進行陽性分選，獲得CD3+、CD4+和CD8+T細胞。

1.2.3 混合淋巴細胞培養 將純化后的DC以1× 104/孔、T細胞以1.5×105/孔密度加入96孔板。加HVEM抗體的DC與T細胞混合培養實驗分為3組：一組加入HVEM抗體后培養4 d；一組加入HVEM抗體后培養2 d；最后一組不加抗體培養2 d，再加入HVEM抗體繼續培養2 d。各組HVEM抗體的質量濃度為10 ng/mL。同時設置加同型IgG的DC與T細胞混合培養對照組。以上各組根據T細胞的不同，每組又細分為CD3+T細胞組、CD4+T細胞組和CD8+T細胞組，各組均設置單獨DC和T細胞對照組。

1.2.4 T細胞增殖和細胞因子IL-2檢測 以上各組按規定時間培養后，離心吸取上清用于IL-2的檢測，然后各組加入20μL MTT溶液（5 mg/mL）繼續培養4 h，離心并吸棄上清，每孔用PBS洗滌2次后，加入100μL DMSO徹底溶解結晶，酶標儀上于570 nm波長比色。IL-2的檢測采用ELISA檢測試劑盒，按照說明書進行操作，不同組別待檢上清均設復孔進行檢測。

1.3 統計學分析

應用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，實驗組與對照組的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DC的誘導與培養結果

C57BL/6小鼠骨髓細胞經過rmGM-CSF和rm IL-4誘導培養5 d后，細胞體積變大，出現成團現象，部分細胞出現樹突狀突起，吸取非貼壁細胞經流式細胞儀檢測，CD11c+的細胞可達50%～68%。經磁珠陽性選擇法分選純化后，所得細胞在鏡下觀察呈典型的DC形態特征。

2.2 HVEM抗體阻斷BTLA-HVEM相互作用，增強T細胞的活化增殖

實驗結果表明，當T細胞與DC相互作用時，加入HVEM抗體培養4 d、加入HVEM抗體培養2 d、先不加抗體培養2 d后再加入HVEM抗體繼續培養2 d的各實驗組的MTT光密度（D）值均高于同組對照組的D值（圖1、2、3），差異均有統計學意義（P＜0.05），表明加入HVEM抗體阻斷了BTLA-HVEM相互作用向T細胞傳導的負性抑制信號，使得T細胞的活化增殖加強。加入HVEM抗體培養2 d的實驗組實驗結果（圖2）表明，BTLA-HVEM相互作用產生的負性抑制信號在T細胞活化的啟動和早期階段（0～48 h）即可發揮效應。與對照組相比，先不加抗體培養2 d后再加入HVEM抗體繼續培養2 d的實驗組也出現了T細胞活化增殖的加強（圖3），說明T細胞活化的中晚期（48～96 h）也受到BTLAHVEM相互作用的負性信號影響。與加HVEM抗體只培養2天的實驗組相比（圖1，2），加HVEM抗體培養4 d的實驗組T細胞的增殖效應更強，顯示出BTLA-HVEM的負性信號在T細胞活化的全程都發揮作用，包括啟動和早期活化階段。

圖1 加入HVEM抗體培養4 d后，T細胞的活化增殖

圖2 加入HVEM抗體培養2 d后，T細胞的活化增殖

圖3 培養2 d后加入HVEM抗體繼續培養2 d，T細胞的活化增殖

2.3 HVEM抗體阻斷BTLA-HVEM相互作用，增加IL-2的分泌

在T細胞與DC混合培養時，CD3+T細胞組和CD4+T細胞組中加入HVEM抗體的實驗組上清中的IL-2分泌量均高于同組對照組（圖4、5、6），差異有統計學意義（P＜0.05），上述結果說明，阻斷BTLA負性信號可減弱對IL-2分泌的抑制，導致活化T細胞IL-2分泌增加。但CD8+T細胞組分泌的IL-2很低，即使阻斷BTLA負性信號，實驗組與對照組間IL-2的差異也無統計學意義。

圖4 加入HVEM抗體培養4 d后，培養上清中IL-2的含量

圖5 加入HVEM抗體培養2 d后，培養上清中IL-2的含量

圖6 培養2 d后加入HVEM抗體繼續培養2 d，培養上清中IL-2的含量

3 討論

BTLA是B7-CD28家族中發現的第3個抑制性分子，具有與CTLA-4和PD-1相似的結構。經典的觀點認為，CTLA-4和PD-1在靜止T細胞上不表達，在雙信號的作用下，T細胞被激活并在活化的中晚期表達CTLA-4和PD-1分子，從而通過負反饋調節T細胞的活化，收縮免疫應答，防止T細胞應答過強和過度，因此T細胞活化的負反饋調節被公認為免疫系統自穩的重要機制。BTLA組成性高表達在靜止T細胞并且活化后繼續表達，BTLA分子的發現者Murphy根據這一特點在2006年提出［13］，BTLA可能在T細胞活化的各個階段（包括啟動和早期階段）發揮負性調節作用，這是一個重要的理論命題，也是一個重要的科學問題，因為現有關于T細胞活化調節的理論，僅有負反饋調節理論，是否存在其他負性調節模式，尚無相關文獻報道。2009年Miller等［15］證實BTLA信號可以在免疫應答的早期抑制NKT細胞釋放細胞因子和對肝臟組織的損傷。NKT細胞是T細胞中的一個小的亞群，主要參與固有免疫應答。對于主要參與適應性免疫應答的大量其他T細胞群體，仍然沒有見到BTLA信號是否在啟動和早期階段對這些T細胞免疫應答進行負性調節的文獻報道，這一科學問題仍然沒有解決。因此，Murphy等［14］于2010年再次提出BTLA信號可能在T細胞活化的各個階段均可發揮負性調節作用。但時至今日，在國際上仍然沒有學者涉足這一重要科學問題。我們以前在人T細胞上的研究結果，初步證實了BTLA信號可在T細胞活化起始和早期階段發揮負性調節作用［16］，本文結果初步證實了BTLA信號也可在小鼠T細胞活化起始和早期階段發揮負性調節作用，說明在T細胞活化啟動時，不僅有正向的第一、第二信號參與，也有BTLA相關的負性信號參與，對第一、第二信號發揮拮抗作用。上述現象實質上是T細胞活化（或者說T細胞免疫應答）的經典負反饋調節模式之外的另一嶄新的負性調節模式，即提高T細胞活化啟動閾值來抑制T細胞活化。如果這種嶄新的負性調節模式最終得到確證，提示經典的T細胞活化的雙信號學說理論存在缺陷，需要修正和完善。

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Effect of interaction between BTLA and HVEM on T cell activation

WANG Yun-yun1，JIANG Yu-ping2，ZHANG Biao1，GU Zong-jiang1
（Department of Immunology，School of Biology and Basic Medical Science，Soochow University，Suzhou Jiangsu 215007；2.Yancheng Products Quality Supervision and Test Institute，Yancheng Jiangsu 224005，China）

Objective：To investigate the effect of interaction between B and T lymphocyte attenuator（BTLA）and HVEM ofmouse bonemarrow-derived dendritic cells（BMDC）on T cell activation.M ethods：T cells and BMDC from C57BL/6 mouse weremixed and cultured.After blocking HVEM on BMDC by antibodies against HVEM，MTTmethod was used to examine T cell proliferation and the secretion of IL-2 was tested by ELISA kit.Results：In the priming and early phase（0-48 h），ormiddle and later phase（48-96 h），or all phase（0-96 h）ofmixing culture，the proliferation of T cells from experimental groupswith addition of HVEM antibodieswas higher compared with control groups（P＜0.05），and the secretion of IL-2 from CD3+T cell and CD4+T cell groups was also higher compared with control groups（P＜0.05）.Conclusion：The negative signal produced by interaction between BTLA and HVEM played the inhibition role in T cell activation.Especially in the priming and early phase（0-48 h）ofmixing culture of T cells and BMDC，the negative signal from BTLA already played such inhibition role，exhibiting another negative regulation mode different from traditional negative feedback regulation mode and suggesting the existence of multiple negative regulation for T cell activation.

B and T lymphocyte attenuator；T cell；immune regulation

R392

A

1671-7783（2015）04-0290-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y150106

王蕓蕓（1988—），女，碩士研究生；顧宗江（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail：suguzj@163.com

2015-05-12 ［編輯］ 何承志