H-FABP和心肌肌鈣蛋白Ⅰ二聯(lián)試紙條的制備

顧梅，阮秀清，康淑娟，劉宏飛，余江南

（江蘇大學1.藥學院，2.京江學院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

H-FABP和心肌肌鈣蛋白Ⅰ二聯(lián)試紙條的制備

顧梅1，阮秀清1，康淑娟2，劉宏飛1，余江南1

（江蘇大學1.藥學院，2.京江學院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：制備能夠同時檢測心型脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP）和心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）的二聯(lián)試紙條，用于急性心肌梗死的早期和中期輔助診斷。方法：采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，并對其相關(guān)因素進行考察。將膠體金分別與H-FABP和cTnⅠ的單克隆抗體結(jié)合，優(yōu)化膠體金與單克隆抗體結(jié)合的影響因素；將膠體金結(jié)合物噴于玻璃纖維膜上制成金標墊，再分別將另一亞型cTnⅠ和H-FABP單克隆抗體和羊抗鼠IgG包被檢測線T1、T2和質(zhì)控線C，最后與吸水墊、經(jīng)預(yù)處理的樣品墊和底板組裝成二聯(lián)試紙條。結(jié)果：制備的二聯(lián)試紙條檢測H-FABP的靈敏度為10 ng/mL，檢測cTnⅠ的靈敏度為3.0 ng/mL，10 min內(nèi)可判定結(jié)果，層析速度均勻，沒有背景顏色，兩種蛋白之間無交叉反應(yīng)，二聯(lián)試紙條穩(wěn)定性好。結(jié)論：成功制備靈敏度高、層析速度均勻和穩(wěn)定性好的H-FABP/cTnⅠ二聯(lián)膠體金免疫層析試紙條。

心型脂肪酸結(jié)合蛋白；心肌肌鈣蛋白Ⅰ；試紙條；心肌梗死；膠體金免疫層析；雙抗夾心法

心型脂肪酸結(jié)合蛋白（heart-type fatty acid-binding protein，H-FABP）是一類低分子質(zhì)量的新型細胞質(zhì)蛋白質(zhì)，大量存在于心臟，占胞質(zhì)蛋白的15%，少量存在于血液和心臟以外的組織中，血漿參考濃度是1.1～2.1 ng/mL，上限是5 ng/mL［1-8］。血流中乳糜微粒和極低密度脂蛋白釋放出的脂肪酸通過細胞表面的脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白進入細胞內(nèi)后，經(jīng)HFABP攝取并轉(zhuǎn)運至線粒體，從而進入能量代謝體系并最終生成三磷腺苷（ATP），為心肌收縮提供能量［9］。急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）或心肌缺血時，心肌細胞損傷，細胞膜通透性增加，H-FABP由于相對分子質(zhì)量小，且為水溶性，可迅速被釋放進入血液，在心肌細胞損傷發(fā)生1.5 h后出現(xiàn)在血漿中，6 h濃度達到高峰，隨后逐漸下降，24～30 h后回到基線值［1，3］。H-FABP如此迅速恢復(fù)至正常水平得益于其高腎清除率，因此是AMI早期診斷的標志物［10-11］。

心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnⅠ）具有高度的心肌特異性、對心肌損傷程度的高度敏感性及較長的診斷窗口期，正逐漸取代肌酸激酶（CK）同工酶-MB，成為診斷心肌損傷，特別是心肌梗死的特異性標志物。cTnⅠ特異存在于心肌細胞胞質(zhì)，在心肌細胞膜完整狀態(tài)下，不能通過細胞膜進入血循環(huán)，所以健康人血內(nèi)不含或含甚少的cTnⅠ。心肌肌鈣蛋白在心肌受損后，特別是心肌梗死發(fā)生后，能很快地釋放入血，3～6 h出現(xiàn)異常增高，11～24 h達峰值，可超過正常的40倍，持續(xù)7～9 d，檢測窗口長［12］。2007年10月歐洲心臟病學會（ESC）、美國心臟病學會（ACC）、美國心臟協(xié)會（AHA）和世界心臟聯(lián)盟（WHF）組成工作小組發(fā)布了“心肌梗死全球統(tǒng)一定義”標準，推薦使用cTn診斷AMI。

膠體金免疫層析試紙條是將具有特異性的物質(zhì)和IgG分別固定在NC膜上作為T線和C線，膠體金標記物噴涂在結(jié)合物墊上，與加在樣品墊上的待測樣品結(jié)合，通過毛細管作用向前移動，與NC膜上的蛋白結(jié)合，形成聚合物，聚集在相應(yīng)區(qū)域形成視覺可見的紅色條帶［13-14］。膠體金免疫層析技術(shù)具有檢測快速、制備簡便、靈敏度高等優(yōu)點，同時HFABP/cTnⅠ二聯(lián)膠體金試紙條可以同時檢測HFABP和cTnⅠ這兩種蛋白，因此可以同時監(jiān)測AMI的早期和中期狀況，配合相關(guān)檢測儀器，可以定量檢測H-FABP和cTnⅠ的濃度，為急性心肌梗死的診斷提供一種快速、簡便的方法，有良好的臨床應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

氯金酸、枸櫞酸三鈉、牛血清白蛋白（BSA）和酪蛋白鈉（Casein Na）均購自上海捷寧生物有限公司；H-FABP單抗和抗原、cTnⅠ單抗和抗原均購自海肽生物科技有限公司；羊抗鼠IgG、膠體金、樣品墊、金標墊、NC膜、吸水墊和底板均購自上海杰一生物有限公司。其他試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 玻璃器皿的準備 將玻璃器皿用雙蒸水清洗3遍，放在100℃烘箱里烘干，再放入王水（V濃HCl∶V濃HNO3=3∶1）中浸泡24 h后，繼續(xù)用雙蒸水清洗3遍，放在100℃烘箱烘干，備用。

1.2.2 膠體金制備條件的優(yōu)化 膠體金的制備需要考察4個單因素，分別是枸櫞酸鈉的量、首次沸騰時間、第2次沸騰時間和轉(zhuǎn)速。實驗步驟：取40 mL 1%的氯金酸溶液放入經(jīng)王水洗凈并干燥過的50 mL錐形瓶中，分別置于恒溫加熱磁力攪拌器上加熱，并精確調(diào)節(jié)攪拌速度R（r/min），在加熱沸騰t1（min）后，分別一次性快速加入新鮮配制的1%枸櫞酸三鈉（mL）。溶液的顏色一般由黃色→灰色→黑色→紫黑色→紫色→酒紅色變化，加入枸櫞酸三鈉t2（min）后，停止加熱，將溶液冷卻至室溫后，加雙蒸水至溶液體積為40 mL，最后進行質(zhì)量鑒定。4個單因素變量見表1。

表1 膠體金制備的單因素考察

1.2.3 膠體金質(zhì)量鑒定方法［15-16］

1.2.3.1 肉眼觀察膠體金溶液 觀察制得的膠體金溶液顏色、均勻度和透明度，初步判斷其質(zhì)量，如10～20 nm顆粒膠體金是櫻桃紅，20～40 nm顆粒膠體金是酒紅色，40 nm以上的膠體金是紫紅色。如果出現(xiàn)藍色、白色或者渾濁，說明制備的膠體金質(zhì)量差，或者可能是玻璃器皿未洗干凈，污染了膠體金溶液，破壞了膠體金的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。

1.2.3.2 紫外光譜掃描鑒定 將制備好的膠體金溶液用雙蒸水稀釋5倍，在400～600 nm可見光范圍內(nèi)進行紫外可見光掃描。一般膠體金的最大吸收峰在520～530 nm，峰型左右基本對稱。觀察紫外吸收峰的峰形和峰寬大小。通過測定最大吸收峰波長，確定膠體金顆粒的大小。

1.2.3.3 透射電鏡觀察 透射電鏡下分別在200、250、300 kV觀察膠體金的顆粒形態(tài)、大小及均勻度等。取10μL的樣品點在銅網(wǎng)上，放置在培養(yǎng)皿中室溫干燥后，加1滴2%的磷鎢酸，室溫干燥后，在透射電鏡中檢測。理想的金顆粒大小基本相等、均勻一致、無橢圓形及多角形的金顆粒存在。

1.2.4 膠體金和蛋白結(jié)合的條件優(yōu)化 將一定量的20 mmol/L K2CO3溶液滴加到裝有1 mL膠體金的離心管，混勻后每只離心管各繼續(xù)加入一定量的單克隆抗體，稍等片刻（t1），混合均勻，再加入0.5 mL的10%NaCl，靜置片刻（t2）。觀察膠體金顏色變化，并再加入3mL雙蒸水稀釋，掃描紫外光譜并在530 nm測定D值，以單因素和D值分別為橫縱坐標作曲線，取曲線斜率最低點處為單因素最適值。此實驗步驟共考察兩個單因素，分別為最佳pH值（20 mmol/L K2CO3的量）和最適蛋白量，其變量見表2。

表2 膠體金和蛋白結(jié)合的單因素考察

1.2.5 膠體金和蛋白結(jié)合物的制備 按照上述實驗確定好的最佳pH值和蛋白量進行標記，將抗HFABP單抗和抗cTnⅠ的單抗分別加入膠體金溶液中，30 min后加入BSA，繼續(xù)靜置30 min，將標記好的膠體金蛋白結(jié)合物溶液置于恒溫離心機中，6 000 r/min，4℃離心15 min；吸出上清液再以8 400 r/ min，4℃離心30 min，兩次都保留金標沉淀。

1.2.6 金標恢復(fù)液的優(yōu)化 將制備的金標沉淀，按照30%V金標沉淀+70%V金標恢復(fù)液（V表示體積）的比例制備噴金液（金標恢復(fù)液1號是含有1%BSA、0.05%PEG和0.1%Tween-20的Tris-HCl液，2號是1%的酪蛋白、15%的海藻糖和30%的蔗糖，3號是1%的酪蛋白、15%的蔗糖和1%的PVP），將已經(jīng)制備好的膠體金-蛋白結(jié)合物用移液器均勻涂在經(jīng)過預(yù)處理的結(jié)合墊上，其他條件不變，將結(jié)合墊與NC膜、樣品墊、吸水墊和PVP板組裝，切成4 mm寬的試紙條，按照結(jié)合墊在層析5 min時的層析速度以及殘留物的多少選擇金標恢復(fù)液。

1.2.7 NC膜單克隆抗體的包被 將濃度為0.8 mg/mL的羊抗鼠IgG包被在C線上，濃度為3 mg/ mL的cTnⅠ和0.2 mg/mL的H-FABP單抗分別包被在T1線和T2線，放置在37℃烘箱里1.5～2 h后取出，放置在塑封袋內(nèi)備用。

2 結(jié)果和討論

2.1 膠體金的制備條件優(yōu)化

2.1.1 枸櫞酸鈉量的優(yōu)化 膠體金顆粒的大小主要受檸檬酸三鈉量的影響，枸櫞酸鈉量越多，制備所得的膠體金顆粒的粒徑越小，紫外光譜掃描所得的可見吸收峰值越小。當加入枸櫞酸鈉的量從0.15 mL逐漸增加到1 mL時，制得的膠體金顆粒的顏色從咖啡色、玫紅色到桃紅色變化（圖1）。因此可以通過加入不同量的枸櫞酸鈉制備不同大小膠體金顆粒。本實驗需要制備40 nm的膠體金顆粒，根據(jù)購自上海杰一公司的膠體金顆粒的吸收峰值在530 nm，本實驗加入1%枸櫞酸鈉的量應(yīng)選擇0.5 mL來還原40 mL的0.01%的氯金酸溶液。

圖1 枸櫞酸鈉量對膠體金顆粒粒徑的影響

2.1.2 第1次沸騰時間的優(yōu)化 沸騰2 min后加枸櫞酸鈉制得的膠體金呈玫紅色，而在氯金酸沸騰后立刻加枸櫞酸鈉所制得的膠體金為酒紅色，更加接近購自杰一公司的膠體金顏色。紫外掃描光譜圖中峰半寬越小，表示制得的膠體金顆粒的粒徑分布越均勻，在氯金酸加熱沸騰后立刻加入枸櫞酸鈉制得的膠體金顆粒的粒徑分布更加均勻。見圖2。因此第1次沸騰時間選擇0 min。

圖2 首次沸騰時間對膠體金顆粒粒徑的影響

2.1.3 第2次沸騰時間的優(yōu)化 第2次沸騰時間不同所制得的膠體金顏色相差不大；當加入枸櫞酸鈉后沸騰10 min時，所制得的膠體金的半峰寬最小，此條件下，膠體金粒徑分布更加均勻，因此第2次沸騰時間選擇10 min。見圖3。

圖3 第2次沸騰時間對膠體金顆粒均勻度的影響

2.1.4 轉(zhuǎn)速的優(yōu)化 當轉(zhuǎn)速為300 r/min時，半峰寬最小，膠體金顆粒的粒徑分布最均勻；當轉(zhuǎn)速為100 r/min時，膠體金的顏色為玫紅色；當轉(zhuǎn)速為300 r/min時，膠體金顏色為酒紅色，接近杰一公司的產(chǎn)品。因此，應(yīng)選擇300 r/min的轉(zhuǎn)速。見圖4。

2.1.5 膠體金顆粒的檢驗 本實驗制備的膠體金顆粒的顏色與杰一公司相像，通過透射電鏡可以觀察到膠體金顆粒分布均勻，粒徑在40 nm左右（圖5）。

圖4 膠體金制備轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

圖5 制備的膠體金顆粒（透射電鏡×30萬）

綜上分析，經(jīng)過可見光吸收光譜和透射電鏡判斷，選擇本實驗?zāi)z體金制備的最佳條件為40 mL的0.01%氯金酸水溶液在300 r/min的攪拌速度加熱至沸，沸騰后立即加入枸櫞酸鈉還原劑，反應(yīng)10 min后停止攪拌，室溫冷卻，并定容至40 mL，儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 膠體金和蛋白結(jié)合

2.2.1 最佳pH值 采用K2CO3調(diào)節(jié)pH值，通過目測法得知，當pH太小或者太大時，膠體金都會變色。原因是pH小于單抗的等電點p I，單抗帶正電荷，膠體金帶負電荷，兩者結(jié)合過強形成聚合物而聚沉；當pH值遠大于單抗的等電點p I，溶液堿性太強，單抗帶負電荷，膠體金也是負電荷，相互排斥而不能結(jié)合。在加入NaCl鹽離子時，由于單抗不能保護膠體金而使膠體金聚集沉淀變成藍色；而pH值在標記蛋白的等電點或略偏堿性，與膠體金靜電結(jié)合，單抗保護了膠體金，在加入NaCl鹽離子時，顏色不變。由圖6可知，H-FABP的1，2，5，6，8號試管變色，因此檢測3，4和7號試管的D值；cTnⅠ的1號和5～7號試管變色，因此檢測2～4號管的D值。由測得的D值看，標記H-FABP的20 mmol/L K2CO3的加入量為30μL，cTnⅠ的20 mmol/L K2CO3的加入量為35μL（表3），其D值最大，膠體金和蛋白結(jié)合的酸堿環(huán)境最佳。

圖6 在不同的pH值下結(jié)合兩種蛋白后的膠體金顏色

表3 膠體金溶液的D值對應(yīng)的K 2 CO3體積

2.2.2 最佳蛋白量 當單抗量比較少時，膠體金變色，而隨著單抗量增加，膠體金顏色不變，原理是膠體金是一種帶負電的疏水性顆粒，未加單抗或加入的單抗量不足時，膠體金和蛋白結(jié)合未達到飽和，蛋白沒有完全保護膠體金，有膠體金結(jié)合位點裸露，當加入NaCl后由于鹽離子效應(yīng)，會改變膠體金的性質(zhì)，出現(xiàn)由紅變藍的聚沉現(xiàn)象，這種情況下試紙條的靈敏度降低甚至出現(xiàn)假陽性。由圖7可知，H-FABP的1號和2號試管變色，因此對3～6號試管檢測紫外吸收峰值（D值）；cTnⅠ的1號和2號試管變色，同理檢測3～5號試管紫外吸收峰值（D值）。當HFABP的單抗量為3μL，cTnⅠ的單抗量為2.5μL，其D值最大（表4）。最佳蛋白量一般在此基礎(chǔ)上增加20%，因此，H-FABP的最佳蛋白量是3.6μL，cTnⅠ的最佳蛋白量為3μL。

圖7 加入不同量蛋白的膠體金顏色

表4 不同蛋白量測得的D值

與圖5中顯示的顆粒比較，膠體金蛋白結(jié)合物（GNP）的直徑有所增加，而且在膠體金外圍有白色的環(huán)（圖8），表明蛋白已經(jīng)通過靜電吸附在膠體金表面，膠體金和H-FABP、cTnI的偶聯(lián)率達100%［17］。

2.3 金標恢復(fù)液的優(yōu)化

金標恢復(fù)液可以使高速離心完的膠體金結(jié)合物重懸于液體中，形成溶液，在4℃環(huán)境下可以長期放置，而且在制成成品試紙條時可以長期保持活性，延長有效期。本實驗考察3種不同的恢復(fù)液，以穩(wěn)定性作為標準來確定最終的恢復(fù)液。

圖8 膠體金蛋白結(jié)合物（透射電鏡×60萬）

由圖9可知，試紙條放置1周后，1號的殘留物很多，2號和3號殘留物明顯較少。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，3號點樣后，液體在結(jié)合墊停留的時間很長，層析效果不好。因此，選擇2號金標恢復(fù)液。可能原因是膠體金結(jié)合物在干燥過程中與結(jié)合墊結(jié)合了，而2號的恢復(fù)液中有海藻糖或者蔗糖，在結(jié)合墊表面形成一層光滑的薄膜，防止膠體金結(jié)合物綴合在結(jié)合點上，同時，光滑的薄膜極易水解，有利于膠體金結(jié)合物釋放進入樣品液中，并隨之層析到NC膜中，因此，可以提高靈敏度、層析速度等［18］。1號恢復(fù)液中不含有糖類，不能在結(jié)合墊形成一層光滑的薄膜，因此金標殘留物最多；3號恢復(fù)液中含有的糖類比2號少，因此金標殘留物比2號多。

圖9 3種金標恢復(fù)液的考察結(jié)果

2.4 二聯(lián)試紙條的層析結(jié)果

由圖10可知，陰性樣品點樣時，只有C線顯色，T1和T2未顯色；當樣品中只有H-FABP時，C線和T2線顯色；當樣品中只有cTnⅠ時，C線和T1線顯色；當樣品中既有H-FABP，又有cTnⅠ時，C線、T1線和T2線都顯色。這說明H-FABP和cTnⅠ之間沒有干擾，這兩種蛋白可以合并在一條試紙條上一起檢測。這樣可以減少取樣量，減少患者的痛苦，節(jié)省檢測時間，減少了AMI診斷時間和醫(yī)療費用。

圖10 H-FABP和cTnⅠ的試紙條

3 結(jié)論

本實驗制備膠體金采用的檸檬酸三鈉還原法，影響膠體金顆粒大小的因素是氯金酸與枸櫞酸鈉量的比值。當氯金酸量一定時，枸櫞酸鈉量越多，制備所得的膠體金顆粒的直徑越小；而其他影響因素如磁力攪拌的速度、沸騰時間等主要影響膠體金顆粒的質(zhì)量。當這些條件處于最優(yōu)時，制備的膠體金顆粒大小均勻，呈類似圓形或者橢圓形。膠體金與蛋白結(jié)合的pH值應(yīng)處于蛋白的pI或者略大于pI值，此時因為靜電吸附，蛋白包裹在膠體金的周圍形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

膠體金免疫層析技術(shù)是以雙抗夾心法為原理，如果待測樣品中有H-FABP和cTnⅠ的抗原時，當液體層析到結(jié)合墊時，兩種抗原分別與相應(yīng)的膠體金結(jié)合物特異性結(jié)合。cTnⅠ的結(jié)合物在NC膜上通過毛細管作用層析到T1線，又與包被在T1線的單克隆抗體特異性結(jié)合，形成類似“三明治”的結(jié)構(gòu)，因此出現(xiàn)肉眼可識別的紅色條帶。樣本中cTnⅠ的濃度越高，檢測線區(qū)出現(xiàn)紅色帶的時間越短、顯色越深［3］。T2線同理。不論待測樣本中是否存在 HFABP或者cTnⅠ，當層析液繼續(xù)遷移至C線（包被羊抗鼠IgG抗體）時，在該區(qū)出現(xiàn)另一條紅色帶，C線的條帶顏色不會隨著抗原濃度的增加而增加，只跟包被在C線的羊抗鼠IgG的濃度有關(guān)。該二聯(lián)試紙條具有檢測準確、快速等特點，不僅適合于醫(yī)院的急診室及床邊檢測，而且也適合家庭等任何場所的檢測，可用于早期和中期AMI的輔助診斷，并為定量診斷提供了前期基礎(chǔ)。

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Preparation of heart-type fatty acid-binding protein and cardiac troponinⅠbivalent strip

GU Mei1，RUAN Xiu-qing1，KANG Shu-juan2，LIU Hong-fei1，YU Jiang-nan1
（1.School of Pharmacy，2.Jingjiang College，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To develop the bivalent strip of human heart-type fatty acid binding protein（HFABP）and cardiac troponinⅠ（cTnⅠ）using colloidal gold immunochromatography technology with principles of double-antibody sandwich assay，for the early and mid-assisted diagnosis of acutemyocardial infarction.M ethodsThe colloidal gold was prepared by trisodium citrate reduction method，and its related factors were investigated.Colloidal gold particles labelled withmonoclonal antibody of H-FABP and cTnⅠ，respectively，were coated on some glass fiber and dried；similarly，its factorswere optimized.The othermonoclonal antibody of cTnⅠ，H-FABP and goat anti-mouse IgG were blotted on the test one line，test two line and control line of nitrocellulose membrane，which were prepared with the absorbent pad，the pretreated sample pad and PV floor into a bivalent strip.Results：The test strip of H-FABP and cTnⅠdetection sensitivity was 10 ng/mL and 3.0 ng/mL，respectively，the result can be determined within 10 min，that have uniform speed chromatography，no background，no crossover between the two proteins response and good stability.Conclusion：It prepared H-FABP/cTnⅠcolloidal gold bivalent strip of high sensitivity，uniform speed chromatography and good stability，successfully.

heart-type fatty acid-binding protein；cardiac troponinⅠ；strip；myocardial infarction；gold immunochromatography；sandwich method

R541；R446.61

A

1671-7783（2015）04-0349-07

10.13312/j.issn.1671-7783.y150035

江蘇省高等學校大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃資助項目（201413986014X）

顧梅（1988—），女，碩士研究生；余江南（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail：gm15052926912@163.com

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2015-03-09 ［編輯］陳海林