巢式熒光PCR結合高分辨熔鏈曲線檢測結核分枝桿菌及其亞型

邵雪君，朱宏，黃莉莉，陶云珍，徐俊，何萍，汪健

（蘇州大學附屬兒童醫(yī)院1.檢驗科，2.普外科，江蘇蘇州215003）

巢式熒光PCR結合高分辨熔鏈曲線檢測結核分枝桿菌及其亞型

邵雪君1，朱宏1，黃莉莉1，陶云珍1，徐俊1，何萍1，汪健2

（蘇州大學附屬兒童醫(yī)院1.檢驗科，2.普外科，江蘇蘇州215003）

目的：建立一種檢測結核分枝桿菌及其亞型的PCR方法。方法：根據人型及牛型結核分枝桿菌硝酸還原酶（nitrate reductase，narGHJI）基因啟動子區(qū)215位上T-C的轉換，設計巢式熒光PCR結合高分辨熔鏈曲線檢測結核分枝桿菌及其亞型，測定其敏感性，并用瓊脂糖凝膠電泳驗證觀察巢式熒光PCR產物的特異性。以人型結核桿菌標準株（H37Ra）、卡介苗培養(yǎng)菌液、人型臨床分離株和牛型臨床分離株為標本，高分辨熔鏈曲線分析結核分枝桿菌亞型正態(tài)化熔鏈曲線及熔鏈溫度。結果：巢式熒光PCR特異性地檢出結核分枝桿菌narGHJI基因，其敏感性比熒光定量PCR高10倍左右；人型及牛型結核分枝桿菌narGHJI基因PCR產物的高分辨熔鏈曲線分成2個不同組合，熔鏈溫度分別為（83.08±0.08）℃和（83.96±0.09）℃，差異有統計學意義（t=217.23，P＜0.05）。結論：成功建立檢測結核分枝桿菌及其亞型的巢式熒光PCR結合高分辨熔鏈曲線法。

結核分枝桿菌；巢式PCR；熔鏈曲線；亞型

結核分枝桿菌感染是威脅公眾健康的疾病之一。據中國疾病預防控制中心公共衛(wèi)生科學數據中心統計數據顯示（http：//www.phsciencedata.cn），我國2012年肺結核發(fā)病總數為951 508例，2013年達129萬多，而2014年統計每月有10萬左右的發(fā)病例數。結核分枝桿菌的感染常采用結核菌素純蛋白衍生物試驗（PPD）或胸部X線檢查來篩檢，PPD陽性結果僅表示可能有活動性結核分枝桿菌感染，而胸部X線檢查發(fā)現率較低，為0.05%～2.63%［1-2］。若能敏感、特異地從體液或痰標本中檢出結核分枝桿菌，則能為結核的早期診斷及干預治療提供確切依據。另外，若能對兩類主要的結核分枝桿菌—人型及牛型結核桿菌做出分型，則能對理解結核的感染源、感染途徑等提供重要信息，有利于結核的防治。因此，我們擬建立一種熒光PCR方法，同時根據結核桿菌硝酸還原酶基因（nitrate reductase，narGHJI）啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性，設計特異性引物，采用高分辨熔鏈曲線分析結核分枝桿菌亞型，以敏感、特異、快速地檢測臨床標本中是否存在人型或牛型結核分枝桿菌。

1 材料與方法

1.1 卡介苗培養(yǎng)及菌落計數

將卡介苗凍干粉劑0.25 mg（蘇州市疾病預防控制中心惠贈）溶于200μL生理鹽水，取100μL接種于分枝桿菌液體培養(yǎng)基（美國BD公司）中，于35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 d，達到對數生長期。測定并調整菌液濃度D（600 nm）=0.45（BiomerieuX分光光度計）。將菌液按1∶1 000稀釋后，取10μL接種于羅氏培養(yǎng)基（珠海貝索生物技術有限公司），置35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 d，進行菌落計數。2份同一稀釋度菌液各重復3次。

1.2 卡介苗菌液基因拷貝定量

取100μL卡介苗菌液［D（600 nm）=0.45］，采用2種方法抽提核酸。一種為直接裂解法，按結核分枝桿菌基因熒光定量試劑盒（達安基因）說明書操作：取100μL卡介苗菌液，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入50μL裂解液，98℃孵育10 min，冷卻，12 000 r/min離心5 min，上清液即為檢測待用的核酸樣本。另一種采用硅膠膜離心柱法（北京天根生化科技有限公司），具體操作按說明書進行。兩種不同方法獲得的核酸均采用結核分枝桿菌基因熒光定量試劑盒（達安基因）檢測結核分枝桿菌基因拷貝數（拷貝/mL）。同一菌液2種方法各重復10管。

1.3 巢式熒光PCR檢測結核分枝桿菌

1.3.1 樣本 取上述膜抽提法獲得的卡介苗核酸分別按1∶1，1∶10，1∶100，1∶1 000，1∶10 000，1∶100 000，1∶1 000 000進行梯度稀釋。

1.3.2 巢式熒光PCR 根據Stermann等［3］方法稍作修改檢測結核桿菌的narGHJI基因。其中巢式熒光PCR第1輪擴增上游引物為5′-AACCGACGGTGTGGTTGAC-3′，下游引物為5′-ATCTCGATGGATGGGCGTC-3′，25μL反應體系含雙蒸水15.7μL，10×緩沖液2.5μL，MgCl2（25 mmol/L）3μL，dNTP 0.5μL，上下游引物（終濃度為10μmol/L）各0.5 μL，Taq酶（5 U/μL，Promega公司）0.3μL，DNA模板2μL；反應條件采用touch-down法：95℃變性10 min，95℃15 s，68℃至62℃15 s，72℃延伸30 s，45個循環(huán)（Bio-Rad iCycle公司）；其中前5個循環(huán)的退火溫度設置在68℃，隨后每個循環(huán)下降1℃直至62℃。第2輪擴增上游引物為5′-CGCCGTCAACTTGGTTAGA-3′，下游引物為5′-GTCCTGCCCGGAAGTTGT-3′，采用Roche公司LightCycler 480 High Resolution Melting Master試劑盒，反應體系含Master Mix 10μL，MgCl2（25 mmol/L）1.0μL，上下游引物（終濃度為10μmol/L）各0.25μL，雙蒸水3.5μL，第1輪PCR稀釋產物（1∶100稀釋）5μL。反應條件為95℃15 min熱啟動，95℃5 s，54℃10 s，40個循環(huán)（Roche LightCycler 480）。每個稀釋度均重復3管。

1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳 對巢式熒光PCR第2輪產物進行瓊脂糖凝膠電泳。根據第2輪PCR引物設計，陽性擴增產物為108 bp，觀察在相應片段位置是否有特異性產物。

1.3.4 巢式熒光PCR敏感性評價 對上述樣本同步采用結核分枝桿菌基因熒光定量試劑盒（達安基因）檢測，以評價與巢式熒光PCR檢測的敏感性差異。達安基因試劑檢測按說明書判斷陰性與陽性；巢式熒光PCR以Ct值≤35，擴增曲線呈明顯S型，且陰性對照不出現擴增曲線來判斷為陽性。

1.4 巢式熒光PCR結合高分辨熔鏈曲線檢測分析結核分枝桿菌及其亞型

1.4.1 樣本 人型結核桿菌標準株（H37Ra）、卡介苗培養(yǎng)菌液、人型臨床分離株和牛型臨床分離株各8份，高溫、高壓滅活后采用硅膠膜離心柱法抽提核酸。

1.4.2 巢式熒光PCR結合高分辨熔鏈曲線分析巢式熒光PCR同“1.3.2”，在第2輪PCR結束后增加高分辨熔鏈曲線分析。具體為95℃變性1 min，40℃1 min，65～95℃連續(xù)監(jiān)測熒光，升溫速度為0.02℃/s，每2 s監(jiān)測1次（Roche LightCycler480）。通過儀器自帶的軟件獲得各個樣本的正態(tài)化高分辨熔鏈曲線及相應的熔鏈溫度。每份樣本均重復3管。由于人型及牛型結核分枝桿菌在narGHJI基因啟動子區(qū)215位上存在T-C轉換（人型為T，牛型為C）［3］，故兩者熔鏈溫度存在差異，并呈現不同的正態(tài)化高分辨熔鏈曲線。

1.5 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行數據分析，卡介苗菌液核酸直接抽提法與膜抽提法的基因定量，人型與牛型結核分枝桿菌PCR產物熔鏈溫度的差異采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 卡介苗菌落計數及基因拷貝定量

D（600 nm）=0.45的卡介苗菌液1∶1 000稀釋后，每10μL在Roche培養(yǎng)基上的菌落數分別為29、29、28、28、27、26 CFU。因此，D（600 nm）=0.45的卡介苗菌液的活菌濃度為2.8×106CFU/mL。

直接裂解法及硅膠膜離心柱法提取的卡介苗核酸基因拷貝數分別為（1.33±0.24）×106拷貝/mL和（1.57±0.35）×106拷貝/mL，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 巢式熒光PCR檢測結核分枝桿菌及其敏感性

建立的巢式熒光PCR熒光擴增曲線如圖1所示，卡介苗菌液擴增曲線呈明顯S型，陰性對照未出現熒光增加；瓊脂糖凝膠電泳驗證陽性擴增產物在108 bp處，無引物二聚體及其他非特異性條帶，提示巢式熒光PCR擴增反應體系獲得了結核分枝桿菌narGHJI基因特異性擴增片段。

巢式熒光PCR和達安基因熒光定量試劑檢測不同稀釋度的卡介苗核酸［硅膠膜離心柱法獲得，初始濃度為（1.57±0.35）×106拷貝/mL］，達安基因熒光定量試劑的檢出限為1∶10 000，對應的預期拷貝數為1.57×102拷貝/mL，而巢式熒光PCR的檢出限為1∶100 000，對應的預期拷貝數為1.57×10拷貝/mL（圖1）。巢式熒光PCR產物采用瓊脂糖凝膠電泳在1∶1～1∶10 000管中處觀察到108 bp長度的陽性擴增產物，檢出敏感性與達安基因熒光定量試劑一致。由此可見，巢式PCR比達安基因熒光定量試劑及巢式熒光PCR產物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測相對高一個數量級，相對敏感性最高。

圖1 不同方法檢測結核分枝桿菌及其敏感性、特異性

2.3 巢式熒光PCR結合高分辨熔鏈曲線檢測分析結核分枝桿菌及其亞型

巢式熒光PCR特異性地檢出H37Ra、卡介苗培養(yǎng)菌液、人型臨床分離株和牛型臨床分離株narGHJI基因，陽性擴增曲線均呈典型S型，陰性空白對照擴增曲線未出現熒光增加。結合高分辨熔鏈曲線分析，由于人型和牛型結核桿菌narGHJI基因啟動子區(qū)215位上存在T-C轉換，故二者熔鏈曲線圖分成2個明顯不同的組合，其熔鏈曲線的正態(tài)化圖如圖2所示。人型及牛型結核桿菌PCR產物的熔鏈溫度分別為（83.08±0.08）℃和（83.96±0.09）℃，差異有統計學意義（t=217.23，P＜0.05）。

圖2 巢式熒光PCR結合高分辨熔鏈曲線檢測結核分枝桿菌亞型

3 討論

結核分枝桿菌常規(guī)的檢測方法有抗酸染色鏡檢法及培養(yǎng)法；抗酸染色鏡檢法樣本中通常細菌需104～106/mL可獲陽性結果；培養(yǎng)法相對更加敏感，但仍需要10～100個細菌/mL才可獲得診斷，且獲得結核分枝桿菌的陽性培養(yǎng)結果約需3～6周［4］。中國疾病預防控制中心公共衛(wèi)生科學數據中心2012統計數據顯示，在951 508例肺結核發(fā)病總數中，除81 744例未進行痰檢外，涂片或培養(yǎng)檢出結核桿菌的總數為348 773例，檢出率為40.10%（348 773/869764）。因此，一方面說明涂片或培養(yǎng)檢出結核桿菌的陽性率并不高，需采用敏感性更高的方法去檢測；另一方面，此統計數據僅為肺結核發(fā)生情況，還不包括肺外結核，如骨、生殖系統等，在一定程度上還低估了結核的陽性率。

目前，PCR由于具有敏感、特異和快速等特點而逐漸成為檢測結核分枝桿菌的有效方法［5-6］。考慮到有些標本中的結核桿菌含量很低，尤其是潛伏感染，故采用巢式PCR或熒光PCR具有更高的敏感性。另外，世界范圍內人型結核分枝桿菌是人類結核的主要病原，牛型結核分枝桿菌引起的人類結核約占到所有人類結核病例的3.1%左右，引起肺或肺外結核分別占2.1%及9.4%［7］。發(fā)展中國家的人類新發(fā)的結核病例中約10%～15%由牛型結核桿菌引起［8］。所有的牛型結核桿菌對一線抗結核藥物——吡嗪酰胺天然耐藥［8-9］，早期鑒別牛型結核桿菌亞型就可避免采用含該藥的四聯療法，減少耐藥菌株的產生。

傳統的熒光PCR，包括采用熒光染料或TaqMan探針等，與巢式PCR后瓊脂糖凝膠電泳觀察通常具有相似的敏感性，這與本研究結果一致；但在巢式PCR的第2輪設計中采用熒光PCR，則可進一步提高檢測的靈敏度，實驗結果顯示巢式熒光PCR比傳統的熒光PCR及巢式PCR后瓊脂糖凝膠電泳高出一個數量級，因此，采用巢式熒光PCR在進一步提高檢測靈敏度上是切實可行的。另外，我們根據人型和牛型結核桿菌narGHJI基因啟動子區(qū)215位上T-C的轉換及相應PCR產物熔鏈溫度間的差異，通過高分辨熔鏈曲線分析，可有效鑒別人型和牛型結核桿菌。

商品化的試劑盒內含的核酸抽提一般采用直接裂解法，對一些特殊標本可能并不適用；此外，原材料直接裂解不能有效去除內含的PCR反應可能抑制物，而硅膠膜離心柱法可排除雜質的影響，避免可能存在的PCR反應抑制物，獲得高純度的核酸材料。因此，我們比較了兩種核酸抽提方法，雖然膜抽提法的均值相對高于直接裂解法，但兩者差異無統計學意義，因此，實際操作中可根據標本來源采用合適的核酸抽提方法。

總之，我們建立的巢式熒光PCR結合高分辨熔鏈曲線檢測結核分枝桿菌及其亞型的方法，既可敏感、特異地檢出結核分枝桿菌，有利于早期篩檢出感染病例，又可對人型和牛型結核做出初步分型，具有較好的實用性，值得推廣使用。

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Nested fluorescent PCR combined w ith high resolution melting curve to detect and distinguish Mycobacterium tuberculosis strains

SHAO Xue-jun1，ZHU Hong1，HUANG Li-li1，TAO Yun-zheng1，XU Jun1，HE Ping1，WANG Jian2
（1.Department of Clinical Laboratory，2.DepartmentofGeneral Surgery，Children′s Hospital of Soochow University，Suzhou Jiangsu 215003，China）

Objective：To establish a PCR method for detection of Mycobacterium tuberculosis strains.M ethods：According to the T-to-C transition at position 215 prior to the start codon of nitrate reductase gene（narGHJI）between Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis，a nested fluorescent PCR combined with a high-resolutionmeltassaywas designed.The sensitivity of themethod was determined by comparing the quantitative resultswith commercial quantitative reagentusing Mycobacterium bovis BCG as specimen，and the PCR products were observed by agarose gel electrophoresis to verify the specificity.Then，themethod was applied to analyze the normalized melt curves and melting temperatures of the PCR product among Mycobacterium tuberculosis（H37Ra），Mycobacterium bovis BCG，clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis and bovis.Results：narGHJI in Mycobacterium tuberculosiswas detected specifically by nested fluorescent PCR，and the sensitivitywas higher than comparedmethod about10 fold.By analyzing themelting curves of the PCR product for Mycobacterium tuberculosis using high-resolutionmelt assay，Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium boviswas divided by each other into two different combinations，and themelting temperature for Mycobacterium tuberculosis（83.08±0.08）℃was significantly lower than Mycobacterium bovis（83.96±0.09）℃（t=217.23，P＜0.05）.Conclusion：A nested fluorescent PCR combined with high-resolution melt assay was established successfully to detect and distinguish Mycobacterium tuberculosis strains.

Mycobacterium tuberculosis；nested PCR；melting curve；strain

邵雪君（1971—），男，江蘇蘇州人，副主任技師，博士，主要從事血液學與分子生物學研究；汪健（通訊作者），主任醫(yī)師，wj196312@vip.163.com

R378.91；R393

A

1671-7783（2015）04-0342-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y150054

蘇州市科技發(fā)展項目（SYS201248）；蘇州市科技支撐計劃社會發(fā)展項目（SS201244）

2015-03-20 ［編輯］ 劉星星