ADAM17在胰腺癌細胞中的表達及其對細胞增殖遷移的影響

吳衡

（江蘇大學附屬宜興醫院ICU，江蘇宜興214200）

ADAM17在胰腺癌細胞中的表達及其對細胞增殖遷移的影響

吳衡

（江蘇大學附屬宜興醫院ICU，江蘇宜興214200）

目的：探討解整合素金屬蛋白酶17（a disintegrin and metalloproteinase-17，ADAM17）在人胰腺癌細胞株中的表達及其對細胞增殖遷移的影響。方法利用實時定量PCR法和蛋白質印跡法檢測3種人胰腺癌細胞株內ADAM17 mRNA和蛋白的表達水平。構建可誘導表達ADAM17-shRNA的慢病毒載體，轉染人胰腺癌細胞株，并篩選出穩定轉染的克隆細胞株。在不同濃度（0，30μg/mL）的多西環素誘導ADAM17-shRNA表達后，通過CCK-8法和細胞劃痕實驗檢測人胰腺癌細胞的體外增殖、遷移能力。結果：ADAM17 mRNA及蛋白在人胰腺癌細胞株PANC1、SW1990和Patu8988中均有表達。與未誘導表達ADAM17-shRNA的對照組相比，誘導表達特異性ADAM17-shRNA后，細胞ADAM17蛋白表達和體外增殖、遷移能力均受到明顯抑制（均P＜0.05）。結論：ADAM17在人胰腺癌細胞中高表達，在其增殖、遷移過程中可能發揮重要作用。

解整合素金屬蛋白酶17；腫瘤壞死因子-α轉化酶；胰腺癌；增殖；遷移

胰腺癌是一種惡性程度極高的消化道腫瘤，其發病率和死亡率近年來明顯上升。由于其診斷和治療都很困難，5年生存率＜1%，是預后最差的惡性腫瘤之一。解整合素金屬蛋白酶17（a disintegrin and metalloproteinase，ADAM17）是一種在體內廣泛分布的Ⅰ型跨膜蛋白，是體內最主要的TNF-α裂解蛋白酶，能特異性水解跨膜型腫瘤壞死因子-α（TNF-α）前體，使其成為可溶性的TNF-α，體內90% TNF-α的裂解依靠其發揮作用［1-2］，因此最初稱其為腫瘤壞死因子-α轉化酶。ADAM17在多種惡性腫瘤組織中過度表達，可反映腫瘤的惡性程度，并在腫瘤的侵襲、轉移過程中發揮重要作用，與腫瘤患者的預后關系密切。本文旨在探討ADAM17在胰腺癌細胞中的表達及其對細胞增殖、遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人胰腺癌PANC1、SW1990和Patu8988細胞株，人胚腎293T細胞，慢病毒骨架質粒Tet-pLKO-puro（Addgene公司）及包裝質粒（PHR′-CMV-8.2△VPR、PHR′-CMV-VSVG）為本實驗室保存；DMEM及胎牛血清（Gibco公司），LipofectamineTM2000試劑（Invitrogen公司），PCR試劑盒及膠回收試劑盒（TaKa-Ra公司），Stbl3超級感受態細胞，Eco R I、Age I、T4DNA連接酶（Fermentas公司），質粒大提及小提試劑盒（Omega公司），嘌呤霉素、多西環素及MTT（Sigma公司），蛋白酶抑制劑及PVDF膜（德國Roche公司），PMSF、BCA試劑盒（碧云天生物公司），鼠抗人β-肌動蛋白抗體（Bioworld公司），兔抗人ADAM17和pAKT抗體（Cell Signal公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人胰腺癌SW1990，PANC1，Patu8988細胞株于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養至對數生長期，以2×105個/mL密度接種于6孔板內，繼續培養48 h。

1.2.2 實時定量PCR檢測ADAM17 mRNA表達水平 取上述3種細胞，用Trizol法提取細胞總RNA，反轉錄后行PCR擴增。ADAM17引物序列上游：5′-TTATTGGTGGTAGCAGAT-3′；下游：5′-AAGTGTTCCGATAGATGT-3′，產物長度為440 bp。β-肌動蛋白上游：5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′；下游：5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，產物擴增長度為218 bp，引物均由上海生工生物技術公司合成。實時PCR反應條件：95℃30 s，54℃30 s，72℃30 s，40次循環。以β-肌動蛋白的表達作為內參照，計算基因的相對表達量。目的基因相對表達水平的計算公式：2-△△Ct=2-（△Ct目的基因-△Ct標準值），并以SW1990細胞株ADAM17 mRNA的相對表達作為100%。

1.2.3 蛋白質印跡法檢測ADAM17蛋白的表達按蛋白濃度測定試劑盒（BCA）說明書操作，測定上述3種細胞蛋白濃度。取20μL樣品進行SDSPAGE，200 mA轉膜1.5 h，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，兔抗人ADAM17（1∶1 000）一抗、鼠抗人β-肌動蛋白（1∶5 000）4℃過夜，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后顯色攝片。

1.2.4 慢病毒質粒構建 根據人ADAM17 mRNA序列，選擇與pLKO.1質粒相兼容的ADAM17 shRNA寡核苷酸，sh-ADAM17正義鏈：5′-CCGGCCAGCAGCATTCGGTAAGAAACTCGAGTTTCTTACCGAATGCTGCTGGTTTTTG-3′；反義鏈：5′-AATTCAAAAACCAGCAGCATTCGGTAAGAAACTCGAGTTTCTTACCGAATGCTGCTGG-3′，含干擾靶序列的DNA寡核苷酸由上海生工生物工程公司合成，用TE液稀釋至1μg/μL，于95℃沸水中加熱5 min，緩慢冷卻至室溫生成雙鏈RNA。慢病毒骨架質粒Tet-pLKO-puro經Eco RⅠ及AgeⅠ雙酶切，膠回收酶切的骨架質粒，與退火形成的雙鏈干擾序列經T4DNA連接酶連接，并轉入Stbl3超級感受態細胞中，挑取3個單克隆轉化子，進行菌液PCR。上游序列：5′-GGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGA-3′；下游序列：5′-TGCCATTTGTCTCGAGGTCG-3′，取陽性菌液再擴大培養進行質粒小提得到較純的sh-ADAM17慢病毒質粒。

1.2.5 慢病毒包裝、收獲 包裝病毒前1天取對數生長的人胚腎293T細胞接種于10 cm培養皿中，用不含雙抗的10%FBSDMEM培養，第2天匯合度達60%～70%時，換無血清DMEM，按sh-ADAM17慢病毒質粒∶包裝質粒PHR′-CMV-8.2△VPR∶包裝質粒PHR′-CMV-VSVG=4μg∶3μg∶1μg的比例用LipofectamineTM2000試劑共同轉染人胚腎293T細胞，6 h后換含10%FBS的DMEM繼續培養。收集48和72 h的病毒上清液，4℃4 000 r/min離心10 min去除細胞碎片，分裝于EP管中并于-80℃保存。

1.2.6 誘導穩定干擾細胞株的干擾序列表達并檢測干擾效果 感染病毒的前1天取處于對數生長期的PANC1和Patu8988細胞分別種于6孔板內，使第2天細胞匯合度達60%～70%，感染病毒時換含聚凝胺的培養液，每孔加入500μL病毒液，使聚凝胺的最終濃度為8μg/mL。37℃、5%CO2中培養1 d，第2天重復感染1次，第3天用嘌呤霉素的最低篩選濃度進行篩選。pLKO-sh-ADAM17細胞種于6孔板內，細胞貼壁后，在DMEM中加入30μg/mL的多西環素處理，同時將未用多西環素誘導的細胞作為陰性對照組。繼續培養48 h，然后提取蛋白，按BCA法檢測蛋白濃度，取20μL樣品進行SDSPAGE，200 mA轉膜2 h，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，分別用兔抗人ADAM17和pAKT（1∶1 000）一抗、鼠抗人β-肌動蛋白（1∶5 000）4℃過夜，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后顯色攝片，分析shRNA對ADAM17的干擾效果。

1.2.7 誘導ADAM17-shRNA干擾序列的表達并用CCK-8法檢測細胞增殖的變化 取對數生長期的PANC1-pLKO-sh-ADAM17和Patu8988-pLKO-sh-ADAM17細胞，分別以4×104/mL密度接種于96孔板，將細胞分為兩組，每組設5個復孔，其中將未用多西環素誘導的細胞作為陰性對照組，另一組采用30μg/mL多西環素誘導。細胞貼壁后，換含有相應濃度多西環素的DMEM繼續培養至第3天，每孔換成含10%CCK8無血清培養基繼續孵育0.5 h后終止培養。在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的光密度值（D值）。腫瘤細胞增殖率（%）=D值誘導組/D值對照組×100%。

1.2.8 誘導PANC1-pLKO-sh-ADAM17細胞中干擾序列的表達并用細胞劃痕實驗觀察細胞遷移的變化

先用標記筆在6孔板背后均勻劃2道橫線，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。在孔中分別接種約5 ×105個已誘導表達ADAM17-shRNA干擾序列的PANC1細胞（按照實驗步驟“1.2.7”提及的方法處理細胞）。第2天用槍頭垂直于背后的橫線劃痕。用PBS洗滌細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養基，放入37℃、5%CO2培養箱中培養。分別在劃痕后0，12以及24 h攝影，觀察劃痕處的細胞生長狀況并計算劃痕區域面積，根據以下公式計算：劃痕區域面積=細胞未覆蓋劃痕區域面積/原有劃痕區域面積×100%。

1.9 統計學處理

數據以均數±標準差表示，應用SPSS 17.0統計軟件分析，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩組均數的比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05或P＜0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ADAM17在胰腺癌細胞株中的表達

實時定量PCR和蛋白質印跡法檢測結果表明，ADAM17在PANC1、SW1990和Patu8988胰腺癌細胞株中均有表達，且在PANC1細胞株中表達量最高。見圖1。

圖1 3種未經處理的胰腺癌細胞株中ADAM 17蛋白及mRNA的表達

2.2 shRNA干擾ADAM17表達的鑒定及其對胰腺癌細胞生長的影響

成功構建穩轉細胞株后，用多西環素誘導ADAM17-shRNA表達，蛋白質印跡法檢測結果表明pLKO-sh-ADAM17能有效干擾胰腺癌PANC1和Patu8988細胞株ADAM17蛋白的表達。同時我們還發現ADAM17下游節點分子AKT磷酸化水平也相應地下調。見圖2。細胞生長抑制實驗顯示，與未誘導表達ADAM17-shRNA的對照組比較，誘導組下調ADAM17的表達后，PANC1和Patu8988細胞株增殖率明顯下降（P均＜0.05）。見圖3。

圖2 多西環素誘導后兩種胰腺癌細胞株中ADAM 17蛋白的表達水平

圖3 多西環素誘導后兩種胰腺癌細胞株的相對增殖率

2.3 shRNA干擾ADAM17的表達對胰腺癌細胞PANC1遷移能力的影響

細胞劃痕實驗結果表明，劃痕后12和24 h，下調多西環素組ADAM17的表達能明顯增加劃痕區域面積，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），表明下調ADAM17的表達能抑制PANC1細胞的遷移。見圖4。

圖4 多西環素對PANC1細胞遷移能力的影響

3 討論

ADAM17屬于解整合素-金屬蛋白酶家族成員，與基質金屬蛋白酶家族（MMPs）一樣都屬于含鋅蛋白酶，能降解細胞外基質，具有蛋白剪切酶樣的作用，能使一些與細胞膜結合的配體或細胞因子如TNF-α、雙調蛋白、轉化生長因子-α（TGF-α）和表皮生長因子（EGF）等脫落［3-5］，并能活化表皮生長因子受體（EGFR），從而調節細胞的多種生物學行為。由于這些配體已被證明在腫瘤的形成與進展中起重要作用，因此推測ADAM17分子參與了惡性腫瘤的發生及侵襲過程［6］。

既往研究發現ADAM17在胃癌、肝癌、肺癌和乳腺癌等多種癌細胞中表達增高，其可通過EGFRPI3K-AKT信號通路促進癌細胞的增殖、侵襲和遷移［7-9，10］。Kenny等［11］通過siRNA或者腫瘤壞死因子-α轉化酶抑制劑下調ADAM17的表達，可阻礙雙調蛋白、TGF-α的脫落和EGFR的活化，從而降低腫瘤的惡性程度。劉宏斌等［10］的研究顯示，食管鱗癌組織中ADAM17 mRNA和蛋白的表達水平明顯高于正常食管黏膜組織；ADAM17的表達與EGFR表達呈正相關，且兩者的表達是食管鱗癌患者預后的獨立影響因素。

既往有研究顯示［12］，ADAM17在正常胰腺細胞中不表達或低表達，而在胰腺癌細胞中高表達。本實驗首先檢測了3種胰腺癌細胞株中ADAM17蛋白質和mRNA的表達，表明ADAM17與胰腺癌的發生、發展可能相關。其次我們通過構建sh-ADAM17慢病毒載體，轉染PANC1和Patu8988細胞，并與未誘導表達ADAM17-shRNA的對照組比較。結果顯示，shRNA能有效干擾ADAM17蛋白的表達，同時ADAM17下游節點分子AKT磷酸化水平也相應下調，說明ADAM17的表達可能通過AKT信號通路起作用。細胞生長抑制實驗結果顯示，與未誘導表達ADAM17-shRNA的對照組比較，下調誘導組PANC1和Patu8988細胞株ADAM17的表達能明顯抑制胰腺癌細胞的增殖。為了進一步闡明ADAM17對胰腺癌細胞生長的影響，本研究通過細胞劃痕實驗，表明下調PANC1細胞株ADAM17的表達能明顯抑制細胞的遷移。

有文獻報道［13］，多西環素具有抑癌作用，但對胰腺癌是否具有抑制作用未見報道，且本實驗使用多西環素作為誘導劑的濃度較低，因此可忽略其對胰腺癌細胞產生的影響。

綜上所述，ADAM17能促進胰腺癌細胞的增殖、遷移，ADAM17可能通過AKT信號通路在胰腺癌發生、發展中起重要作用，可作為胰腺癌治療的一個新的靶點。

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Expression of ADAM 17 and its effect on proliferation and m igration in pancreatic cancer cell

WU Heng
（Department of Intensive Care Unit，the Affiliated Yixing Hospital of Jiangsu University，Yixing Jiangsu 214200，China）

Objective：To investigate the expression of a disintegrin and metalloproteinase-17（ADAM17）of human pancreatic cancer cell and it′s effect on proliferation and migration in human pancreatic cancer cell.M ethods：The protein and mRNA expression of ADAM17 in three human pancreatic cancer cellwere detected by using quantitative real-time PCR and Western blotting.The inducible lentiviral vectorsmediated short hairpin RNA（shRNA）interference targeting ADAM17 gene were constructed，and transfected it into pancreatic cancer cell line，then screened stably transfected clonal cell line.After different doxycline concentration to induce the expression of ADAM17-shRNA，cell proliferation and migration were analyzed by using the Cell Counting Kit-8（CCK-8）viability assay and scratch assay.Results：ADAM17 protein and mRNA were highly expressed in PANC1，SW1990 and Patu8988 human pancreatic cancer cells.After small interfering RNA（siRNA）to block the expression of ADAM17，the protein levels of ADAM17，cell proliferation and migration in the experiment group were significantly lower than that of control group（all P＜0.05）.Conclusion：ADAM17 protein and mRNA have been expressed highly in human pancreatic cancer cell and promotes the proliferation and migration of human pancreatic cancer cell.

a disintegrin andmetalloproteinase-17；TNF-αconverting enzyme；pancreatic cancer；proliferation；migration

R73-362

A

1671-7783（2015）04-0299-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y140163

吳衡（1983—），男，江蘇宜興人，主治醫師，碩士，主要從事腫瘤診治研究。

2014-05-30 ［編輯］陳海林