長鏈非編碼RNA UCA1對胰腺癌PANC-1細胞系侵襲轉移的影響

趙義，張尤歷，張行行，王國英，龔愛華，劉鑫，徐岷

（1.江蘇大學附屬醫院消化內科，江蘇鎮江212001；2.江蘇大學醫學院，江蘇鎮江212013）

長鏈非編碼RNA UCA1對胰腺癌PANC-1細胞系侵襲轉移的影響

趙義1，張尤歷1，張行行1，王國英1，龔愛華2，劉鑫1，徐岷1

（1.江蘇大學附屬醫院消化內科，江蘇鎮江212001；2.江蘇大學醫學院，江蘇鎮江212013）

目的：探討尿路上皮癌抗原1（urothelial carcinoma antigen 1，UCA1）在胰腺癌細胞中的表達及其對胰腺癌PANC-1細胞系侵襲轉移的影響。方法用熒光定量PCR法檢測4種胰腺癌細胞系中UCA1的表達水平，選取PANC-1細胞系，將其隨機分為對照組和實驗組，對照組細胞轉染空載Vector，實驗組細胞轉染UCA1表達質粒，比較兩組細胞UCA1表達水平；Transwell遷移實驗和Transwell侵襲實驗分別檢測兩組細胞遷移和侵襲能力；蛋白質印跡檢測兩組細胞MMP14、MMP2和MMP9蛋白表達。結果：UCA1差異性表達于4種胰腺癌細胞系中；與對照組相比，實驗組細胞的遷移和侵襲能力明顯增強（P＜0.01），細胞中MMP14、MMP2和MMP9的蛋白表達水平均明顯增加（P＜0.01）。結論：上調UCA1促進胰腺癌PANC-1細胞的體外侵襲轉移。

胰腺癌；腫瘤轉移；長鏈非編碼RNA；尿路上皮癌抗原1

胰腺癌是致死性最強的實體腫瘤之一，約40%患者在確診時已發生轉移［1］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）雖無編碼蛋白質的功能，卻以RNA的形式參與調控染色體沉默、細胞分化、細胞凋亡和腫瘤發生發展等多種生物學過程［2］。研究發現，lncRNA在腫瘤轉移中發揮重要的調控作用［3］，如H19［4］和MALAT-1［5］可促進胰腺癌的侵襲轉移。

尿路上皮癌抗原1（urothelial carcinoma antigen 1，UCA1）是一種膀胱癌特異性lncRNA［6］。研究發現UCA1在食管癌［7］、肝癌［8］和結直腸癌［9］等消化道腫瘤中發揮致癌基因作用。Yang等［10］研究指出UCA1可能與胰腺癌有一定的關系。但是，UCA1在胰腺癌中的表達及其可能的作用尚不清楚。因此，本研究擬初步探討UCA1在胰腺癌細胞系中的表達及其對PANC-1細胞遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM高糖培養基、Opti-MEM、FBS（美國Gibco公司），MillicellRHanging Cell Culture Inserts（美國Millpore公司），BD BioCoatTMMatrigelTMInvasion Chamber（美國BD公司），Trizol試劑（美國Invitrogen公司），反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒（日本TaKaRa公司），基質金屬蛋白酶（matrixmetallopeptidase，MMP）14、MMP2、MMP9和β-肌動蛋白單克隆抗體（美國Affinity公司），UCA1表達質粒和相應的空載Vector由美國密西西比大學Mo Yin-Yuan教授惠贈。

1.2 細胞培養

胰腺癌PaTu8988、BxPC-3、SW1990、和PANC-1細胞系由本實驗室凍存。用含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養基于37℃含5%CO2的恒溫培養箱培養人胰腺癌細胞系。

1.3 提取總RNA、反轉錄和熒光定量PCR

收集對數增殖期的細胞，用預冷PBS清洗3遍，按照Trizol說明書提取細胞總RNA，蛋白核酸分析儀檢測其純度及濃度，-80℃保存備用。按照反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄成cDNA，然后以cDNA為模板擴增U6和UCA1。熒光定量PCR的反應體系為25μL，反應條件為95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40個循環。用2-ΔΔCt計算基因的相對表達量（RQ值），計算公式為RQ=2-ΔΔCt，ΔCt=Ct目的-Ct內參，ΔΔCt= ΔCt實驗-ΔCt對照。

1.4 細胞轉染

將細胞隨機分為對照組和實驗組，對照組細胞轉染空載質粒，實驗組細胞轉染UCA1表達質粒。轉染前1天將PANC-1細胞接種至6孔培養板，每孔5×105個細胞，保證細胞在24 h內匯合度達到80%～90%。按照LipofectamineTM2000說明書操作，將質粒和LipofectamineTM2000分別加入250μL Opti-MEM中，室溫靜置5 min，將二者混合，輕柔混勻，靜置20 min后將500μL質粒/LipofectamineTM2000混合物逐滴滴入6孔培養板，于培養箱中孵育48～72 h后進行后續實驗。

1.5 Transwell遷移實驗和侵襲實驗

1.5.1 Transwell侵襲實驗 轉染48 h后收集細胞，用無血清DMEM清洗細胞2遍，然后用無血清DMEM重懸細胞，調整細胞濃度為1×106/mL，在小室下層加入含10%FBS的DMEM，上層則加入200 μL細胞懸液，培養箱中孵育24 h后取出小室，用干棉簽輕輕擦去小室上層未穿過Matrigel膠的細胞，再用PBS潤濕的棉簽擦拭2遍，小室浸入4%低聚甲醛，室溫固定30～60 min，然后將小室浸入0.1%結晶紫中染色30～60 min，用PBS清洗小室數次，室溫風干。在200倍顯微鏡下隨機計數5個視野的細胞數，所有實驗重復3次。

1.5.2 Transwell遷移實驗 步驟同侵襲實驗，只是將Matrigel膠包被的小室換成不含膠的小室即可。

1.6 蛋白質印跡法檢測細胞MMP的表達

轉染48～72 h后收集細胞，用預冷PBS清洗3遍，加入適量RIPA/PMSF裂解液，冰上裂解30 min，4℃，14 000×g離心15 min，取上清液。蛋白樣品經10%SDS-PAGE分離后轉移至PVDF膜，5%牛血清白蛋白于搖床上室溫封閉2 h，一抗（β-肌動蛋白稀釋比為1∶20 000，MMP14、MMP2和MMP9稀釋比均為1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min；HRP標記的二抗（稀釋比例為1∶5 000）于37℃溫箱中孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；ECL發光顯影，凝膠成像系統分析處理。

1.7 統計學分析

用SPSS 16.0軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差±s）表示，兩均數比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 UCA1 mRNA在4種胰腺癌細胞系中的表達

qRT-PCR結果顯示UCA1差異性表達于4種胰腺癌細胞系中，其中PaTu8988中UCA1相對表達量最低，其次為PANC-1，而BxPC-3中UCA1的水平相對最高，綜合考慮，本實驗選取PANC-1細胞作為研究對象。見圖1。

2.2 UCA1在不同質粒中的表達

轉染質粒后，實驗組細胞的UCA1相對表達量（800.86±21.67）明顯高于對照組（1.00，t=-73.84， P＜0.01），表明轉染UCA1質粒后，UCA1表達水平升高。

圖1 UCA1 m RNA在4種胰腺癌細胞系中的表達

2.3 上調UCA1對PANC-1細胞遷移的影響

Transwell遷移實驗結果顯示，實驗組細胞的遷移細胞數明顯高于對照組（t=-22.67，P＜0.01），表明上調UCA1的表達促進PANC-1細胞的遷移。見圖2。

圖2 兩組PANC-1細胞的遷移能力比較

2.4 上調UCA1對PANC-1細胞侵襲的影響

Transwell侵襲實驗結果顯示，實驗組中穿過Matrigel膠的細胞數明顯高于對照組（t=-17.43，P＜0.01），表明上調UCA1的表達促進PANC-1細胞的侵襲。見圖3。

2.5 上調UCA1對MMP14、MMP2和MMP9蛋白的影響

如圖4所示，實驗組細胞中MMP14、MMP2和MMP9的蛋白水平明顯高于對照組（P均＜0.01），表明上調UCA1的表達促進MMP14、MMP2和MMP9蛋白的表達。

3 討論

最初研究認為lncRNA是基因轉錄過程的“副產物”。近年來，研究指出lncRNA在表觀遺傳學、轉錄水平和轉錄后3個層面調控基因表達，參與多種疾病的發生發展，尤其是腫瘤［11］。其中一些lncRNA如UCA1、PCGEM1和ANRIL等可促進腫瘤的發生發展，而lincRNA-p21、GAS5和MEG3等作為抑癌基因在腫瘤生物學過程中發揮調控作用。UCA1差異性表達于絨毛組織、胎盤組織和各種胎兒器官，在成年組織中不表達，而在多種腫瘤中表達，提示UCA1可能是一種癌胚基因，在胚胎發育和腫瘤形成中發揮重要作用［12］。食管癌中高表達的UCA1可促進細胞增殖、遷移和侵襲［7］。Wang等［8］發現肝癌組織中UCA1表達明顯高于癌旁組織，干擾UCA1的表達可抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Han等［9］發現UCA1過表達促進結直腸癌細胞的生長并抑制其凋亡，提示UCA1在消化系腫瘤中表現為致癌基因。然而，UCA1在胰腺癌中的表達及其可能的作用還不清楚。

圖3 兩組PANC-1細胞的侵襲能力比較

圖4 兩組細胞MMP14、MMP2和MMP9的表達

本研究結果表明，UCA1差異性表達于4種胰腺癌細胞系，選取UCA1表達相對較低的PANC-1細胞作為研究對象，轉染UCA1表達質粒用于上調PANC-1細胞的UCA1水平；Transwell侵襲實驗和遷移實驗結果顯示，上調UCA1后，PANC-1細胞的遷移和侵襲能力明顯增強。Yang等［13］發現沉默膀胱癌細胞的UCA1表達后，MMP14表達明顯下降。MMP14可活化MMP2和MMP9［14］，而MMP2和MMP9在胰腺癌的轉移中起重要作用［15］。本研究結果顯示，上調UCA1后，PANC-1細胞的MMP14、MMP2和MMP9表達均增加。由此可見，UCA1可能通過影響MMP的表達在胰腺癌的侵襲轉移中發揮重要作用。

綜上所述，上調UCA1通過增加MMP14、MMP2和MMP9的表達促進胰腺癌細胞的遷移和侵襲。胰腺癌的轉移機制比較復雜，本研究僅初步探討UCA1在胰腺癌細胞轉移中的作用，關于UCA1在胰腺癌轉移中的調控作用尚需深入研究，如應用RNA pull down實驗檢測UCA1的靶蛋白。隨著研究的不斷深入，UCA1有望成為胰腺癌靶向治療的新位點。

［1］ Teague A，Lim KH，Wang-Gillam A.Advanced pancreatic adenocarcinoma：a review of current treatment strategies and developing therapies［J］.Ther Adv Med Oncol，2015，7（2）：68-84.

［2］ Di Gesualdo F，Capaccioli S，Lulli M.A pathophysiological view of the long non-coding RNA world［J］.Oncotarget，2014，5（22）：10976-10996.

［3］ Serviss JT，Johnsson P，Grandér D.An emerging role for long non-coding RNAs in cancer metastasis［J］.Front Genet，2014，5：234.

［4］ Ma C，Nong K，Zhu H，et al.H19 promotes pancreatic cancermetastasis by derepressing let-7′s suppression on its target HMGA2-mediated EMT［J］.Tumour Biol，2014，35（9）：9163-9169.

［5］ Jiao F，Hu H，Han T，et al.Long noncoding RNA MALAT-1 enhances stem cell-like phenotypes in pancreatic cancer cells［J］.Int JMol Sci，2015，16（4）：6677-6693.

［6］ 王宇，陳葳，李旭.UCA1及其剪接變異體與膀胱癌［J］.中國生物化學與分子生物學報，2014，30（7）：642-646.

［7］ Li JY，Ma X，Zhang CB.Overexpression of long noncoding RNA UCA1 predicts a poor prognosis in patients with esophageal squamous cell carcinoma［J］.Int J Clin Exp Pathol，2014，7（11）：7938-7944.

［8］ Wang F，Ying HQ，He BS，etal.Upregulated lncRNAUCA1 contributes to progression of hepatocellular carcinoma through inhibition of miR-216b and activation of FGFR1/ERK signaling pathway［J］.Oncotarget，2015，6（10）：7899-7917.

［9］ Han Y，Yang YN，Yuan HH，etal.UCA1，a long noncoding RNA up-regulated in colorectal cancer influences cell proliferation，apoptosis and cell cycle distribution［J］.Pathology，2014，46（5）：396-401.

［10］ Yang X，Gao L，Guo X，etal.A network basedmethod for analysis of lncRNA-disease associations and prediction of lncRNAs implicated in diseases［J］.PLoSOne，2014，9（1）：e87797.

［11］ Shi X，Sun M，Liu H，etal.Long non-coding RNAs：a new frontier in the study of human diseases［J］.Cancer Lett，2013，339（2）：159-166.

［12］ 謝小娟，李旭，王帆，等.非編碼RNA UCA1基因的細胞定位和組織表達譜分析［J］.南方醫科大學學報，2010，30（1）：57-60，69.

［13］ Yang C，Li X，Wang Y，et al.Long non-coding RNA UCA1 regulated cell cycle distribution via CREB through PI3-K dependent pathway in bladder carcinoma cells［J］.Gene，2012，496（1）：8-16.

［14］ Ulasov I，Yi R，Guo D，et al.The emerging role of MMP14 in brain tumorigenesis and future therapeutics［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1846（1）：113-120.

［15］ Lin Q，Aihara A，Chung W，et al.LRH1 promotes pancreatic cancer metastasis［J］.Cancer Lett，2014，350（1/2）：15-24.

Influence of long non-coding RNA UCA1 on invasion and metastasis of pancreatic cancer cell line PANC-1

ZHAO Yi1，ZHANG You-li1，ZHANG Xing-xing1，WANGGuo-ying1，GONG Ai-hua2，LIU Xin1，XU Min1
（1.Department of Gastroenterology，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；2.School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To investigate the expression of urothelial carcinoma antigen 1（UCA1）in pancreatic cancer cell lines and its influence on the invasion and metastasis of the pancreatic cancer cell line PANC-1.M ethods：The expression level of UCA1 in 4 pancreatic cancer cell lines was detected by realtime PCR.PANC-1 cellswere randomly divided into Vector group and UCA1 group，which was transfected with Vector and UCA1-plasmid，respectively；the UCA1 expression level in two groupswas compared.The ability ofmigration and invasion in vitro in Vector group and UCA1 group weremeasured by Transwellmigration assay and Transwell invasion assay.The protein level of MMP14，MMP2 and MMP9 in two groups was analysed byWestern blotting.Results：UCA1 differentially expressed in 4 pancreatic cancer cell lines.Compared with the Vector group，the ability ofmigration and invasion in UCA1 group were dramatically enhanced（P＜0.01），and the protein level of MMP14，MMP2 and MMP9 in PANC-1 were increased（P＜0.01）.Conclusion：Up-regulation of UCA1 promotes the invasion and metastasis in vitro of PANC-1.

pancreatic cancer；tumormetastasis；long non-coding RNA；urothelial carcinoma antigen 1

R735.9

A

1671-7783（2015）04-0304-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y150081

江蘇省衛生廳科研資助項目（H201434）；鎮江市科技支撐計劃資助項目（SH2014024）

趙義（1988—），男，碩士研究生；徐岷（通訊作者），副主任醫師，碩士生導師，E-mail：peterxu1974@163.com

2015-04-07 ［編輯］ 劉星星