哮喘小鼠肺組織Nuocytes增多與GITR-GITRL表達的關系

張夢瑩，徐蕓蕓，吳靜，張盼，張淡宜，彭靜靜，齊晨，紀曉昀，夏圣，蘇兆亮，王勝軍，許化溪

（江蘇大學醫學院免疫學與免疫檢驗系，江蘇鎮江212013）

哮喘小鼠肺組織Nuocytes增多與GITR-GITRL表達的關系

張夢瑩，徐蕓蕓，吳靜，張盼，張淡宜，彭靜靜，齊晨，紀曉昀，夏圣，蘇兆亮，王勝軍，許化溪

（江蘇大學醫學院免疫學與免疫檢驗系，江蘇鎮江212013）

目的：檢測哮喘小鼠肺組織中Nuocytes相關指標和GITR-GITRL的表達，探討哮喘時Th2極化微環境的改變。方法：選擇8只Balb/c小鼠，隨機分為2組，模型組于第1天，第11天用OVA致敏，第22至26天用2%OVA溶液霧化激發，對照組用PBS處理；采用流式細胞術檢測小鼠肺組織內GITR表達和Nuocytes細胞數量；qRT-PCR法檢測Foxp3、RORα、ICOS、ST2、IL-5、IL-13和GITR及其配體GITRL的mRNA表達水平；對GITR-GITRL和Nuocytes及其相關分子的表達水平進行相關性分析。結果與對照組相比，模型組小鼠肺組織中Nuocytes細胞數和GITR表達均升高，且GITRL、Foxp3、RORα、ICOS、ST2以及IL-5和IL-13 mRNA表達水平均明顯上調；GITR與RORα和ST2、IL-5、IL-13的表達水平均呈正相關。結論：哮喘小鼠肺組織中Nuocytes和GITR-GITRL表達增高，提示哮喘時GITR-GITRL上調的T細胞免疫應答可能與Th2主導的免疫失衡和Nuocytes極化相關。

Nuocytes；GITR；GITRL；哮喘；小鼠

哮喘是一種慢性過敏性氣道炎癥，病理特征主要表現為急性可逆性支氣管氣流受限、支氣管-肺組織高反應性、氣道嗜酸粒細胞浸潤、黏液分泌增多等。目前，普遍認為機體哮喘時的免疫狀態向Th2型偏倚［1］，表現為2型細胞因子和轉錄因子IL-4、GATA3等表達水平升高。

近來發現一新型固有淋巴細胞Nuocytes［2-3］或稱Ⅱ型固有免疫細胞（Group 2 innate lymphoid cells，ILC2s），在哮喘疾病中起重要作用。Nuocytes經IL-25、IL-33刺激活化，產生和分泌大量細胞因子，如IL-5和IL-13等。Nuocytes不表達T/B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞等特異性標志，可誘導共刺激分子（inducible costimulator，ICOS）為陽性［4-5］，維甲酸相關孤核受體α（retinoid acid receptor related orphan receptorα，RORα）是其分化和發揮生物學作用必需的轉錄因子。Nuocytes主要免疫作用是參與Th2應答過程，其極化可能是構成Th2細胞優勢分化的重要因素。

糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體（glucocorticoid-induced TNF receptor family related protein，GITR）是腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族成員之一［6-8］，為Ⅰ型跨膜蛋白，1997年由Nocentini等在雜交瘤細胞株上克隆出，其配體即GITRL。表達有GITR的Treg細胞能有效地發揮免疫抑制作用，控制和維持機體的免疫平衡。而當GITR與其配體GITRL共表達時，GITR-GITRL的相互作用則可消除Treg細胞的免疫抑制功能，并作為免疫應答的正向協同刺激信號，參與免疫性疾病的炎癥損傷過程。本研究擬通過檢測哮喘小鼠肺組織GITRGITRL和Nuocytes的分布以及相關細胞因子的表達水平，分析GITR-GITRL對Nuocytes及其相關分子表達水平的影響，從區域免疫學的角度了解哮喘時Th2極化微環境的變化。

1 材料與方法

1.1 小鼠哮喘模型的建立

SPF（Specific pathogen-free）級雌性Balb/c小鼠（6～8周齡）8只，購自揚州大學比較醫學中心，動物合格證號：No.201403201。隨機分為對照組和模型組，每組4只。模型組建模方法參照文獻［9］并加以改進，即于第1天和第11天腹腔注射致敏液0.1 mL［50μg雞卵清蛋白（OVA）+10%氫氧化鋁凝膠2 mg］，第22天至第26天以無菌PBS配制的2%OVA溶液超聲霧化吸入60 min，最后一次霧化吸入24 h后處死小鼠。對照組用PBS處理。

1.2 試劑

OVA（Sigma公司），Trizol試劑（Invitrogen公司）；反轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa公司）；GITR和Lin單克隆抗體（eBioscience公司），ST2、ICOS單克隆抗體（Biolegend公司）。

1.3 流式細胞術檢測小鼠肺組織GITR的表達和Nuocytes細胞數

取小鼠肺組織，剪碎并用膠原酶消化，篩網過濾和ACK裂解液裂解紅細胞，細胞計數后用抗GITRAPC或抗Lineage-FITC、抗ICOS-PerCP/Cy5.5和T1/ST2-PE作熒光抗體染色，然后用C6流式細胞儀分析。

1.4 RNA提取、引物設計及qRT-PCR

剪取約1/4肺組織塊沖洗，剪碎后加1 mL Trizol提取總RNA，反轉錄成cDNA，再以cDNA為模板進行qRT-PCR（反轉錄和定量試劑均為TaKaRa公司產品）。實驗過程中每份標本均設3個復孔并作3次重復檢測。引物均用Oligo 6軟件設計（表1），由上海生工生物技術公司合成。

表1 引物序列及產物長度

1.5 統計學分析

統計學分析采用GraphPad軟件。組間數據比較用獨立樣本t檢驗，相關性分析用Pearson相關分析法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 哮喘小鼠模型誘導結果

建模后哮喘小鼠表現為煩躁不安，弓背且腹部鼓動明顯，點頭樣喘息，呼吸加深加快等；HE染色鏡下可見哮喘小鼠肺泡間及伴行血管周圍有大量炎癥細胞浸潤、黏膜皺壁減少、杯狀細胞肥大增生，見圖1。與對照組相比，OVA模型組血清總IgE水平明顯升高（t=2.427，P＜0.05）。見圖2。

圖1 模型組小鼠肺組織的病理改變（HE染色×10）

圖2 小鼠血清總IgE水平比較

2.2 肺組織Nuocytes數量和GITR表達水平的改變

流式細胞術檢測結果顯示，與對照組比較，模型組小鼠肺組織內GITR陽性細胞增加，且伴有Nuocytes細胞數增多；免疫熒光抗體染色結果也顯示GITR表達增強；qRT-PCR檢測結果顯示，與對照組比較，模型組小鼠肺組織GITR mRNA表達水平明顯升高。見圖3。

圖3 小鼠肺組織內GITR表達和Nuocytes細胞數量

2.3 哮喘小鼠肺組織GITRL和Nuocytes相關分子的表達

qRT-PCR檢測結果顯示，模型組小鼠肺組織中GITRLmRNA水平明顯高于對照組；此外，Foxp3以及Nuocytes細胞相關分子ICOS、ST2、RORα、IL-5和IL-13 mRNA表達水平均明顯高于對照組（P均＜0.05）。見圖4。

2.4 哮喘小鼠肺組織GITR與Nuocytes相關分子表達水平的相關性分析

相關性分析結果表明，GITR表達與RORα，ST2，IL5和IL-13的表達呈明顯正相關（P均＜0.05）。見圖5。

圖4 GITR-GITRL和Nuocytes相關分子的mRNA表達

圖5 GITR與nuocytes相關分子表達水平的相關性分析

3 討論

支氣管哮喘是以氣道過敏性炎癥為主要病理特征的免疫性疾病，近年來歐共體呼吸健康調查（ESRHS）和國際兒童哮喘與變態反應研究機構（ISAAC）的流行病學調查研究均顯示，哮喘患病率明顯升高。迄今為止，哮喘的病理機制尚不完全清楚。研究表明，哮喘患者體內Th1/Th2細胞處于失衡狀態，Th2細胞呈優勢分化［10］。Nuocytes可分泌大量的IL-5和IL-13，支撐和維持著Th2細胞的極化狀態，促進哮喘的發展。

GITR組成性地高表達于Treg細胞表面，而靜息的初始CD4+T細胞表面表達量相對較低，當抗原刺激活化T細胞后，Treg和CD4+T細胞表面的GITR表達量均會增高［11-13］。在缺乏足夠GITRL時，高表達GITR的Treg細胞具有負向免疫調控作用，而GITR與其配體GITRL結合則構成T細胞活化的協同刺激信號，GITR-GITRL的相互作用影響Treg細胞的增殖及其免疫抑制功能［8-9］。

本研究顯示，哮喘小鼠肺組織內GITR表達和Nuocytes數量升高；GITR及其配體GITRLmRNA表達水平相伴上調，同時nuocytes相關分子ICOS、ST2、IL-5、IL-13及轉錄因子RORα的mRNA水平也明顯升高；GITR-GITRL表達量與Nuocytes細胞相關的細胞因子或轉錄因子水平呈正相關。由此推測，GITR和GITRL相伴高表達，一方面可阻礙Treg細胞的負向調控作用，另一方面可能對Th2細胞極化發揮促進作用。有研究表明，Th2細胞的特異性轉錄因子GATA3是炎癥條件下穩定Foxp3（Treg轉錄因子）表達及功能的正調控因子［14-15］，而Treg細胞中Foxp3也可通過上調去泛素化酶USP21的轉錄和表達，從而維持GATA3蛋白的穩定性［16］。本研究結果顯示，哮喘小鼠肺組織Foxp3 mRNA呈高表達，由此可見其促進Th2細胞的極化。GITR-GITRL高表達與Nuocytes相關細胞因子或轉錄因子的上調呈正相關，可能是直接地相互影響，也可能是間接作用的結果，但最終都導致Th2細胞極化之微環境，構成哮喘的免疫失衡狀態，其具體機制仍待進一步研究。

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Relationship between increased nuocytes and GITR-GITRL expression levels in lung tissue of asthmatic m ice

ZHANGMeng-ying，XU Yun-yun，WU Jing，ZHANG Pan，ZHANG Dan-yi，PENG Jing-jing，QIChen，JIXiao-yun，XIA Sheng，SU Zhao-liang，WANG Sheng-jun，XU Hua-xi
（Department of Immunology，School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To detect the changes of numbers of nuocytes and levels of GITR-GITRL in the lung of asthmaticmice，analyze the relationship between them，then to explore the changes of Th2-polarized micro-environment at the locus of allergic inflammation when with asthma.M ethods：Eightmice were devided into 2 groups randomly，asthmamodelswere sensitized with OVA on 1st，11st day，then nebulized inhalation with OVA on day 22-26，control group with PBS.Flow cytometry was used to detect numbers of nuocytes and cellswhich express GITR；qRT-PCR was also used to test themRNA levels of GITR-GITRL，molecules and cytokines associated with nuocytes；pearson correlation analysiswas used to detect the correlation between GITR-GITRL and nuocytes.Results：Compared with the control group，model group showed high levels of nuocytes and GITR-GITRL，meanwhile，with increased mRNA levels of GITRL，Foxp3，RORα，ICOS，ST2，IL-5 and IL-13；and there was a positive correlation between GITR expression and RORα，ST2，IL-5，IL-13 expression.Conclusion：Nuocytes and the expression of GITR-GITRL increased synchronously in lung of asthmaticmice，which suggested that the up-regulation of T cell-mediated immune response by GITR-GITRLmay be associated with Th2-biased response and polarization of nuocytes.

nuocytes；GITR；GITRL；asthma；mice

張夢瑩（1990—），女，碩士研究生；蘇兆亮（通訊作者），副教授，博士生導師，E-mail：szl30@yeah.net；許化溪（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail：xuhx@ujs.edu.cn

R562.25

A

1671-7783（2015）04-0277-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y150099

國家自然科學基金資助項目（31270947）

2015-05-06 ［編輯］ 劉星星