新型隱球菌vps41Δ氮源饑餓反應的數(shù)字基因表達譜分析

劉曉光，李偉偉，葉 狄

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

新型隱球菌vps41Δ氮源饑餓反應的數(shù)字基因表達譜分析

劉曉光，李偉偉，葉 狄

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

VPS41基因在新型隱球菌的饑餓反應、巨噬細胞中存活以及致病性等過程中起關(guān)鍵作用.為了進一步研究VPS41介導的饑餓反應信號通路相關(guān)基因，利用數(shù)字基因表達譜技術(shù)檢測了在氮源饑餓條件下隱球菌野生型菌株KN99α與饑餓反應缺陷菌株vps41Δ呈顯著差異表達的基因.結(jié)果表明：在氮源饑餓條件下野生型與vps41Δ中呈顯著表達差異的基因共有241個，其中vps41Δ中表達上調(diào)的基因有176個，表達下調(diào)的基因有65個.差異表達的基因主要涉及細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)形成、細胞循環(huán)、次級代謝產(chǎn)物合成、能量代謝等生物過程.以上結(jié)果為迅速克隆鑒定隱球菌VPS41饑餓信號通路的其他關(guān)鍵基因奠定了基礎.

新型隱球菌；數(shù)字基因表達譜；差異表達基因；VPS41信號通路

數(shù)字基因表達譜（digital gene expression profile，DGE）是基于Illumina高通量測序平臺，對某一物種或組織在特定狀態(tài)下基因的表達情況進行檢測的技術(shù).其對樣本中數(shù)以百萬計的cDNA標簽同時進行測序分析，分析系統(tǒng)可以對整個轉(zhuǎn)錄組進行數(shù)字化的處理，從而得到精確、重復率高的mRNA轉(zhuǎn)錄豐度信息［11］.本研究利用數(shù)字基因表達譜技術(shù)對新型隱球菌野生型菌株與vps41Δ菌株在氮源饑餓條件下的整個轉(zhuǎn)錄組進行測序分析，以期檢測兩者呈顯著差異表達的基因，從而加快新型隱球菌VPS41介導的饑餓應答信號通路的闡述，為研發(fā)高效、低副作用的新型抗真菌藥物提供靶標.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

新型隱球菌（C.，neoformans）野生型菌株KN99α，其血清型為A，交配型為α.隱球菌vps41Δ是KN99α 的VPS41基因被定向敲除的菌株，該菌株由本實驗室保藏.

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

酵母完全培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，115，℃滅菌15，min.

YNB培養(yǎng)基（g/L）：YNB 1.7，葡萄糖5，121，℃滅菌20，min.

潮霉素B購自上海生物工程有限公司，Trizol試劑和DEPC均購自美國Invitrogen公司，Tris-飽和酚購自北京博大泰克公司，氯仿購自天津市四通化工廠，無水乙醇購自天津化學試劑二廠.

1.2 實驗方法

1.2.1 待測序?qū)嶒灳甑呐囵B(yǎng)

將隱球菌野生型KN99α與vps41Δ菌株分別接種于5，mL新鮮的YPD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜后以1%的接種量轉(zhuǎn)接至50，mL的YPD液體培養(yǎng)基中（加入200，μg/mL的潮霉素B），培養(yǎng)8，h左右，離心去除上清液，收集菌體，加適量的生理鹽水懸浮菌體.重復洗滌兩次后，用5，mL YNB培養(yǎng)基重懸.將得到的菌懸液饑餓培養(yǎng)6，h后，分別提取菌株的總RNA.

1.2.2 目的菌株總RNA的提取與純化

參照《分子克隆實驗指南》［12］.

1.2.3 RNA-Seq測序

提取樣品總RNA后，交由北京華大基因有限公司測序.總RNA利用Agilent 2100生物芯片分析系統(tǒng)檢測合格后，對其加熱打開二級結(jié)構(gòu)后用帶Oligo（dT）的磁珠富集mRNA.向富集的mRNA中加入適量打斷試劑，高溫條件下使其片段化，再以片段化的mRNA為模板，合成cDNA，經(jīng)過磁珠純化、末端修復、3′末端加堿基A、加測序接頭后，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，并進行PCR擴增.建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI Step-OnePlus Real-Time PCR System進行質(zhì)量和產(chǎn)量檢測，文庫質(zhì)控合格后用Illumina HiSeqTM2000進行測序.

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

測序儀產(chǎn)生的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)Base Calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，以FASTQ的文件格式存儲.由于Raw Data可能包含低質(zhì)量序列、Adaptor序列等，必須經(jīng)過數(shù)據(jù)處理才能用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析.數(shù)據(jù)處理的步驟如下：（1）去除含adaptor的reads；（2）去除N的比例大于10%的reads；（3）去除低質(zhì)量reads（質(zhì)量值Q≤5的堿基數(shù)占整個read的50%以上），然后使用短reads比對軟件SOAPaligner/SOAP2［13］將clean reads分別比對到新型隱球菌的參考基因組（http：// www.broadinstitute.org）和參考基因序列（允許2個堿基錯配），篩選得到樣本間的差異表達基因.差異基因再進行下一步高級分析，包括GO功能顯著性富集分析、Pathway顯著性富集分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 待測菌株總RNA的提取

采用Trizol試劑法提取總RNA，RNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳分析顯示28S rRNA和18S rRNA條帶明亮清晰，且28S rRNA的亮度約是18S rRNA的2倍，表明提取的RNA較完整.對提取的RNA樣品的純度進行定量分析顯示：野生型RNA樣品，1.7＜ A260/A280=1.95＜2.0，A260/A230=2.20＞2；vps41Δ RNA樣品，1.7＜A260/A280=1.98＜2.0，A260/A230= 2.13＞2.表明該RNA樣品純度較高，滿足測序要求.

2.2 RNA-Seq高通量測序和評估

對KN99α 和vps41Δ樣品進行RNA-Seq高通量測序，得到其raw reads分別為5，641 859和5，640 757，其中clean reads分別為5，595 596和5，602 400，分別占raw reads的99.18%和99.32%.去除雜質(zhì)后的clean reads用作后續(xù)分析.使用短reads比對軟件將得到的clean reads分別比對到新型隱球菌參考基因組序列（http：//www.broadinstitute.org），結(jié)果見表1和表2.結(jié)果表明，樣品KN99α 和vps41Δ的clean reads中，分別有84.27%和85.11%匹配到新型隱球菌的參考基因組上.

表1 樣品KN99α 和新型隱球菌參考基因組比對的統(tǒng)計結(jié)果Tab. 1 Alignment statistics of KN99α to the reference genome of C. neoformans

表2 樣品vps41Δ和新型隱球菌參考基因組比對的統(tǒng)計結(jié)果Tab. 2 Alignment statistics of vps41Δ to the reference genome of C. neoformans

測序飽和度分析表明：當clean reads在2×106以下時，檢測到的基因數(shù)與測序量成正比；當達到2×106以上時，趨于平緩；超過4×106時檢測到的基因數(shù)已經(jīng)接近飽和，而樣品KN99α 和vps41Δ的測序量分別為4.34×106和4.77×106.隨后，對測序的隨機性進行了統(tǒng)計，結(jié)果表明樣品KN99α 和vps41Δ的reads在參考基因組上基本成隨機分布.上述結(jié)果表明本次測序結(jié)果能夠較好地反映細胞中基因表達的真實情況，可以用于后續(xù)差異表達基因分析.

2.3 差異表達基因分析

差異表達基因為false discovery rate（FDR）≤0.001且差異倍數(shù)不低于2倍的基因.通過對兩者的基因表達譜進行差異分析，發(fā)現(xiàn)兩者中具有顯著表達差異的基因有241個，其中有176個是在突變株vps41Δ中被上調(diào)的基因，有65個是在vps41Δ中被下調(diào)的基因.其所有基因表達圖如圖1所示.

圖1 新型隱球菌KN99α 和vps41Δ菌株在氮源饑餓條件下所有基因表達圖Fig. 1Gene expression profiles of KN99α and vps41Δof C. neoformans under nitrogen starvation

為了篩選參與調(diào)控VPS41饑餓反應信號通路過程的候選基因，首先只對差異表達倍數(shù)的對數(shù)值較大的，并且P＜0.001的基因進行分析，結(jié)果見表3和表4.

表3 氮源饑餓下vps41Δ下調(diào)2.5倍以上的差異表達基因Tab. 3 Genes with 2.5-fold down-regulation in vps41Δ under nitrogen starvation

表4 氮源饑餓下vps41Δ上調(diào)3.3倍以上的差異表達基因Tab. 4 Genes with 3.3-fold up-regulation in vps41Δ under nitrogen starvation

2.4 差異表達基因GO（GeneOntology）功能顯著性富集分析

GO是國際標準化的基因功能分類體系，提供了一套動態(tài)更新的標準詞匯表（controlled vocabulary）來全面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性.GO功能顯著性富集分析可給出與參考基因比較后在差異表達基因中顯著富集的GO功能條目，并篩選出差異表達基因與哪些生物學功能顯著相關(guān).本實驗用WEGO軟件［14］對差異基因進行GO功能分類統(tǒng)計，從宏觀上認識差異基因的功能分布特征.表達差異基因主要涉及了細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)形成、細胞循環(huán)、次級代謝產(chǎn)物合成、能量代謝等生物過程，如圖2所示.

圖2 差異表達基因GO功能分類圖Fig. 2 The Gene Ontology of differentially expressed genes

2.5 差異表達基因KEGG Pathway顯著性富集分析

在生物體內(nèi)，不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學功能，基于Pathway的分析有助于更進一步了解基因的生物學功能.KEGG是有關(guān)Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫［15］，Pathway顯著性富集分析以KEGG Pathway為單位，應用超幾何檢驗，找出與整個基因組相比較后差異表達基因中顯著性富集的Pathway.P≤0.05的Pathway定義為在差異表達基因中顯著富集的Pathway.通過Pathway顯著性富集能確定差異表達基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導途徑，結(jié)果見表5.

表5 KEGG Pathway顯著性富集結(jié)果Tab. 5 Result of the enriched KEGG Pathways

3 討 論

面對饑餓環(huán)境，隱球菌通過調(diào)整代謝和其他生物過程如停止細胞分裂、啟動細胞自吞噬程序來加速細胞組分再利用，從而降低營養(yǎng)消耗和節(jié)省能源、提高生存率.VPS41基因在隱球菌的抗饑餓反應中起關(guān)鍵作用，其功能的缺陷導致致病力喪失，饑餓條件下隱球菌細胞分裂程序繼續(xù)進行，生存率急劇下降［9］.

為克隆鑒定參與VPS41基因饑餓應答信號通路的其他相關(guān)基因，本研究利用數(shù)字基因表達譜在轉(zhuǎn)錄組水平上揭示了在氮源饑餓條件下野生型菌株與vps41Δ菌株基因表達的差異.在vps41Δ上調(diào)的176個基因中，大部分基因的功能未知，但上調(diào)4倍的CNAG_07756基因預測編碼細胞分裂1個正調(diào)控因子（activator of the anaphase-promoting complex），推測該基因的上調(diào)很可能參與vps41Δ細胞在氮源饑餓條件下的細胞周期失控，確切的功能還有待驗證.

在vps41Δ下調(diào)的65個基因中，通過基因定向敲除和基因過表達實驗對下調(diào)8.8倍的CNAG_05303基因（編碼異檸檬酸裂解酶）和下調(diào)2.5倍的CNAG_06650基因（編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶）進行了初步研究，證實這兩個基因參與隱球菌的饑餓應答反應.

以上結(jié)果表明：數(shù)字基因表達譜是獲得隱球菌參與饑餓反應目標候選基因名單的一種高效方法.針對候選基因，可以通過基因定向敲除、基因沉默以及基因過表達等手段進一步明確其在隱球菌饑餓反應信號通路的功能，從而為在分子水平上闡述新型隱球菌VPS41介導的饑餓反應信號通路奠定基礎.

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責任編輯：常濤

Digital Gene Expression Profiling of vps41Δ of Cryptococcus neoformans Under Nitrogen Starvation

LIU Xiaoguang，LI Weiwei，YE Di
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

VPS41 gene plays an essential role in the starvation response，survival inside macrophages and pathogenicity of Cryptococcus neoformans. To identify other genes involved in the VPS41-mediated starvation response，digital gene expression profiling（DGE）technology was used to determine the differentially expressed genes between the wild strain KN99αand the starvation response defective mutant vps41Δ under nitrogen starvation conditions. The results show that 241 genes in total exhibited significant differences in transcript levels，with 176 genes showing increased expression and 65 genes decreased expression in the vps41Δ mutant strain. These differentially expressed genes were mainly involved in cell morphology formation，cell cycle regulation，secondary metabolite synthesis，energy metabolism and other biological processes. The above results have provided a valuable list of candidate genes for rapid cloning and characterization of genes participating in the VPS41 starvation signaling pathway of C. neoformans.

Cryptococcus neoformans；DEG；differentially expressed genes；VPS41 signaling pathway

Q756 文獻標志碼：A 文章編號：1672-6510（2015）01-0014-05

10.13364/j.issn.1672-6510.20140025

新型隱球菌（Cryptococcus neoformans）是臨床上常見的病原真菌之一，主要感染細胞免疫功能嚴重受損的人群：如艾滋病患者、接受抗腫瘤化療藥物及長期皮質(zhì)激素治療的病人，引起嚴重的隱球菌病及隱球菌性腦膜炎［1-2］.近年來，隨著廣譜抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑的廣泛使用，以及免疫缺陷性疾病和器官移植病例的增加，隱球菌引發(fā)的感染呈明顯上升趨勢，其發(fā)病率在艾滋病患者中高達6.5%［3-5］.因此，新型隱球菌致病機理的研究逐漸引起重視.

已鑒定的新型隱球菌重要的致病因子包括莢膜漆酶、37，℃條件下的生存能力以及抗饑餓能力［6-9］.本文作者之一的前期工作發(fā)現(xiàn)新型隱球菌中VPS41基因?qū)︷囸I條件下細胞的生存能力具有重要作用，VPS41基因的敲除導致突變株抗饑餓能力、巨噬細胞生存能力及致病性的缺失［9］.進一步的研究還發(fā)現(xiàn)在氮源饑餓的條件下，野生型KN99α 的細胞周期能及時停滯在G2期，而vps41Δ突變株則表現(xiàn)為細胞周期停滯程序失控，即在饑餓條件下DNA繼續(xù)復制，細胞周期繼續(xù)進行［10］.然而，有關(guān)新型隱球菌在饑餓環(huán)境下VPS41基因調(diào)控饑餓應答反應的分子機理仍不清楚，因此，有待于進一步鑒定參與饑餓應答信號通路的相關(guān)基因.

2014-05-15；

2014-09-03

國家自然科學基金資助項目（31070125）；天津市自然科學基金資助項目（11JCYBJC26300）

劉曉光（1963—），男，江西人，教授，liu_xg@tust.edu.cn.