PGD2調控TGF-β1/Smads在支氣管哮喘中的實驗研究

劉振峰 劉建英

PGD2調控TGF-β1/Smads在支氣管哮喘中的實驗研究

劉振峰 劉建英

目的 觀察PGD2對小鼠肺成纖維細胞生物學特性的影響，利用其受體特異性抑制劑Laropiprant調控TGF-β1/Smads在支氣管哮喘中的研究。方法 根據Laropiprant的濃度將細胞分組，每組分別加入TGF-β2（2.5ng/mL）培養24h后用Laropiprant刺激24h，分別用PCR法、WB法檢測細胞TGF-β1、smad3和smad4的表達。采用不同濃度的Laropiprant作用于細胞不同時間，通過MTT法檢測Laropiprant對細胞生長的抑制作用。結果 隨著Laropiprant的濃度增加，細胞中TGF-β1、smad3及smad4的mRNA和蛋白的表達呈下降趨勢，與正常對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。不同濃度的Laropiprant作用于細胞不同時間后，其抑制率隨濃度增高和作用時間增長呈下降趨勢。結論 L-929小鼠肺成纖維細胞的中PGD2-DP1的表達可能與TGF-β1/Smads的調節相關。Laropiprant作用于細胞后，其抑制率隨濃度增高和作用時間增長呈下降趨勢。

PGD2；Laropiprant L-929；TGF-β1/Smads；支氣管哮喘

支氣管哮喘是一種慢性非特異性炎性疾病，在疾病的發生進展過程中，由于炎癥對氣道的持續性損傷和機體對損傷的修復性反應而形成的新結構，導致氣道結構發生改變,即氣道重塑，其主要表現為氣道平滑肌和基底膜增厚及細胞外基質的沉積，炎性細胞浸潤和腺體增生肥大的結果是產生持續的氣道高反應性和不可逆性氣道阻塞；是支氣管哮喘肺功能進行性下降的重要病理學基礎，亦是近年來支氣管哮喘研究的熱點、重點之一。因此，應對氣道重塑的其發生機制，本研究將探討PGD2對小鼠肺成纖維細胞生物學特性的影響，利用其受體特異性抑制劑Laropiprant調控TGF-β1/Smads信號通路，為進一步探討氣道纖維化形成的分子機制提供基礎。

1 資料與方法

1.1 材料 L-929小鼠肺成纖維細胞細胞(第三軍醫大學提供)，TGF-β1細胞因子(Gibco公司，USA)，PCR試劑盒(大連寶生物公司)，II級雞卵清白蛋白（Sigma公司，美國）；PGD2受體多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗（CsT公司，美國），BCA蛋白定量試劑盒、PVDF膜（Piece公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法 參照國家標準GB/T1688615-1997“醫療器械生物學評價第五部分:細胞毒性試驗體外法”進行。將凍存的L-929細胞復蘇后，將生長狀態良好的L-929細胞于實驗前1d傳代，第2天用0.25%胰酶(pH為7.8)消化，用DMEM高糖培養基洗細胞兩次(1500r/min，8min)，用含10%小牛血清的DMEM培養基重懸，調整細胞數為2×105/個，鋪于96孔平底板中置于37℃、5%CO2孵箱中孵育4h，待細胞貼壁后，即將實驗細胞按照時間梯度分為12h組、24h組、48h組、72h組，分別加入含10%胎牛血清DMEM高糖培養基稀釋試驗藥物(各組Laropiprant均按0.3μmL、1μmL、3μmL、10μmL比例配置)，同時設正常細胞對照，每孔加入100μL試液，每個稀釋度設5個復孔，置于37℃、5%CO2孵箱中孵育24h，加入5mg/mL MTT20μL/孔(每毫升PBS中溶解5mgMTT，經0.22μL 濾膜濾過以除菌和去不溶物，低溫、避光保存)，37℃、%CO2培養箱中繼續孵育4h后，用預溫的PBS清洗2遍，棄去上清，加入溶解液DMSO 100μL/孔，于微型振蕩器上振蕩5min，使結晶物充分溶解，使用酶聯免疫檢測儀在波長490nm處測定各孔吸光度(OD) 值。根據測定的吸光度值計算其相對的細胞生長抑制率。同樣方法測量48h藥物對實驗細胞生長抑率。抑制率的計算公式:抑制率(100%)=［(對照組的OD值-給藥組的OD值)/對照組的OD值］×100%。

1.2.2 RT-PCR檢測 對數生長期的L-929細胞以5×104個/mL接種于25mL培養瓶內，接種24h，按Laropiprant濃度梯度將細胞分為1組（0.3μmL）、2組（1μmL）、3組（3μmL）、4組（10μmL）、5組（30μmL），每組分別加入TGF-β2（2.5ng/mL）[7]。引物序列:PGD2：上游5’-CGGAATTCATGGTCCACAGCATTCCGCTG-3’，下游5’-CGGGATCCCTAATTGATCCCGCTGCTCA-3’；TGF:上游5’-CCAGATCCTGTCCAAACTAAGG-3’，下游5’-CATGTTGCTCCACACTTGATTT-3’；smad3:上游5’-TGAACACCAAGTGCATTACCA-3’，下游5’-GGAGGTAGAACTGGCGTCTCT-3’；smad4:上游5’-ACATTGGATGGACGACTTCAG-3’，下游5’-TCAATTCCAGGTGAGACAACC-3’。細胞總RNA提取:加藥后繼續培養24h后加入適量的Trizol，將細胞收入EP管中。每個EP管中加入0.05μg/l氯仿0.2mL，加蓋，振搖15s，室溫靜置3min，12000r/min離心15min，吸取上清液移至另一EP管內，加入等體積的異丙醇，混勻，靜置10min，12000r/min離心15min，棄上清，加入75%乙醇1mL，7500r/min離心5min，棄上清，空氣中干燥5～10min，加入DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水30μL溶解RNA，-80℃保存。逆轉錄反應體系:10×RNA PCR buffer 5μL，25mmol/L MgCl24μL，10mmol/L dNTP 1μL，Oligo dT50 pmol，Rnasin 20U，AMV 5U，cDNA 10μL，補加DEPC處理水至20μL。于熱循環儀中95℃預變性

5min，再進行95℃變性1min、57℃退火1min、72℃延伸

1min，共35個循環。PCR產物用1.2%糖凝膠電泳，HB染色后拍照。通過Potoshop 圖像分析系統分析各條帶灰度。

1.2.3 Western blot檢測TGF量 提取總蛋白，BCA法測定濃度。按Laropiprant濃度梯度將細胞分為1組（0.3μmL）、2組（1μmL）、3組（3μmL）、4組（10μmL）、5組（30μmL），每組分別加入TGF-β2（2.5ng/mL）。以每孔40mg上樣，用lO的聚丙烯酸胺凝膠電泳分離蛋白，半干法轉移至PVDF膜上，與小鼠抗兔的GATA-3(1∶1000)和

13-actin(1∶1000)單克隆抗體孵育4℃過夜，洗膜后，用辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠的IgG抗體(1:1000)孵育6h，用發光試劑盒顯示蛋白條帶，使用Gensnap凝膠成像系統拍照。

1.2.4 統計學方法 所有數據采用SPSS13.0統計學軟件進行處理。正態計量資料采用“x±s”表示；2組正態計量數據的組間比較采用t檢驗。計數資料用例數（n）表示，計數資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PGD2-DP1抑制后TGF-β1、smad3及smad4的信號改變 隨著加入Laropiprant的濃度增加，細胞TGF-β1、smad3以及smad4的表達呈下降趨勢，與正常對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1～3。

圖1 TGF-β2刺激L-929細胞后使用Laropiprant抑制PGD2-DP1受體表達，使用PCR和WB法檢測細胞TGF-β1的表達

圖2 TGF-β2刺激L-929細胞后使用Laropiprant抑制PGD2-DP1受體表達，使用PCR和WB法檢測細胞Smad3的表達。

圖3 TGF-β2刺激L-929細胞后使用Laropiprant抑制PGD2-DP1受體表達，使用PCR和WB法檢測細胞smad4的表達。

2.2 Laropiprant抑制PGD2-DP1對小鼠肺成纖維細胞細胞活力的影響 使用EXCEL統計軟件將酶標儀測得的OD值結果轉變為抑制率圖標。細胞抑制率隨濃度增高和作用時間增長呈下降趨勢，Laropiprant在濃度達到1μmol/L，作用時間在24～36h時，細胞生長抑制率明顯升高（見圖4）。

圖4 細胞活力曲線圖

3 討論

支氣管哮喘是由多種炎癥細胞和多種炎癥介質參與的慢性氣道炎癥，受遺傳因素和環境因素的雙重影響[1]，且氣道炎癥與重塑在支氣管哮喘發生發展中起重要作用。近年來關于氣道重構的研究說法不一，而學者普遍認為TGF-β1在氣道炎癥和纖維化中發揮了重要作用。TGF-β1能刺激氣道平滑肌細胞分裂與增殖，導致平滑肌增生和肥厚，促進成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，誘導成纖維細胞合成?型和ó型膠原,誘導支氣管上皮細胞合成?型膠原，參與并促進氣道重塑的形成[2]。Smad蛋白是目前所知的惟一TGF-β1受體的胞內激酶底物，TGF-β1導致氣道重塑的生物活性是通過Smad蛋白信號轉導途徑來實現的。使用ELISA法檢測穩定期的支氣管哮喘哮喘患者支氣管肺泡灌洗液中TGF-β1后發現，其含量顯著高于健康對照組，變應原刺激24小時后的TGF-β1濃度更高[3]。本實驗以小鼠L-929小鼠肺成纖維細胞細胞為研究對象，通過應用TGF-β2刺激細胞產生PGD2，運用RT-PCR和Western blot法來檢測TGF-β1、smad3和smad4的表達，結果提示：隨著PGD2的濃度增加，細胞TGF-β1、smad3和smad4的表達呈下降趨勢，與正常對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。這說明在小鼠氣道慢性炎癥過程中，PGD2受體可能對細胞TGF-β1、smad3和smad4的表達具有調控作用[4-5]，且在慢性氣道炎癥引起的氣道重構中發揮了核心的作用[6-8]。但Vigola[9]上述研究證實的PGD2/DP信號轉導途徑，不僅能抑制成纖維細胞的遷移，也可以調整成成纖維細胞介導前膠原纖維的收縮反應，此結論提示了新的支氣管哮喘氣道重構的發生機制。

PGD2對哮喘免疫反應的雙向調節能力，可作為炎癥介質產生致炎作用。Murray[10]等人在支氣管哮喘患者在吸入塵螨后對其肺泡灌洗液進行檢測，發現其中的PGD2的濃度可增加15倍。PGD2不僅誘導了支氣管收縮，并且促使支氣管收縮的效應強于組胺30倍。在支氣管哮喘患者受到抗原刺激后，其氣道內存在大量PGD2。實驗發現：給予環氧合酶抑制劑后，可部分抑制速發性哮喘反應的嚴重程度，證明了PGD2在慢性氣道炎癥中起到了調節作用。Kohyama[11]等人通過培養人胎兒肺成纖維細胞（HFL-1）進行體外實驗，證明了PGD2不僅抑制HFL-1對人纖連蛋白（HFN）的趨化作用的因子，而且還可以減緩成纖維細胞的遷移。以上都是通過Ca2+依賴PKA信號通路來發揮作用的[12]。這種作用體現在氣道炎癥損傷后修復過程中，成纖維細胞過度聚集太少不利于損傷的修復，而成纖維細胞過多則會發生變形，使組織喪失的功能結構。

綜上所述，L-929小鼠肺成纖維細胞中的PGD2-DP1受體可能與TGF-β1/Smads的調節相關，兩者之間的關系為正相關，這與相關報道一致，但是本實驗仍未涉及其具體調控機制的研究。此外，在活體復雜的環境中，PGD2對TGF-β1/Smads的調控規律也有待進一步研究。

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Objective To explorer PGD2 biological characteristics in mice lung fibroblasts cell by Laropiprant is a specific inhibitor of PGD2receptor regulation of TGF-β1/Smads signaling pathway.Provide further basis research to explore the molecular mechanisms of airway fibrosis. Methods The cells divided by Laropiprant concentration 1 (0.3μmol) group, 2 (1μmol) group, 3 (3μmol) group, 4 (10μmol) group, 5 (30μmol) and the control group. Each group were added TGF-β2(2.5ng / mL) were cultured for 24 hours after stimulation with the corresponding concentrations of Laropiprant 24h, TGF-β1smad3and smad4expression were detected by PCR and WB, respectively. A randomized approach, using different concentrations of Laropiprant (0.3μmol, 1μmol, 3μmol, 10μmol, 30μmol)acts on cells at different times (12h, 24h, 48h, 72h, 96h) by MTT assay for cell growth Laropiprant inhibition.Results TGF-β1, smad3and smad4mRNA expression decreased with the addition of Laropiprant concentration increases, there was significant difference compared with the control group with (P＜0.05). TGF-β1, smad3and smad4protein expression decreased with the addition of Laropiprant concentration increases, there was significant difference compared with the control group with (P ＜0.05). Cell growth inhibition rate decreased with Laropiprant concentration increasing and cell culture time growth, Laropiprant in concentration 1μml, reaction time was 24 to 36h, the cell growth inhibition was significantly improved.Conclusion PGD2-DP1expression in L-929 mouse lung fibroblasts cell may be associated with TGF-β1/ Smads regulation.

PGD2; Laropiprant L-929; TGF-β1/Smads; Biological characteristics

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.2.002

貴州 563003 遵義市第一人民醫院呼吸內科 （劉振峰 劉建英）

劉建英 E-mail:ljy2317@126.com