我國藥用植物原生質體培養的研究進展

尹紅新　雷秀娟　宋娟等

摘要：對近年來藥用植物原生質體的制備、培養、融合以及植株再生進行了綜述，闡明了起始材料、酶解條件、培養方法等對原生質體培養的影響，并對今后藥用植物原生質體的重點研究方向作了討論。

關鍵詞：藥用植物；原生質體；酶解條件；培養；研究進展

中圖分類號：Q942 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0243-03

原生質體（protoplast）是指植物細胞中除去細胞壁后有生命活性的部分，除去細胞壁的原生質體能夠直接攝入外源的細胞器、DNA、病毒、質粒等，是進行遺傳轉化研究的理想受體，對其進行細胞融合可獲得雜種細胞[1]。因此，植物原生質體在品種改良和生物學基礎理論研究中有廣泛的應用前景，備受國內外研究學者的關注。1892年，Klercker首次用機械法進行原生質體的分離研究，但是原生質體獲得量很少[2]。1960年，Cocking采用酶解法從高等植物細胞中分離獲得原生質體[3]。隨著纖維素酶和果膠酶的推行，植物原生質體培養逐漸成為一個熱門話題[4]。1971年，Takebe等首次從煙草葉片中分離出原生質體并獲得再生植株，原生質體的培養進入一個新的階段[5]。在此基礎上，藥用植物原生質體的培養也有了一定的發展。目前，藥用植物原生質體的培養已經擴展到夾竹桃科、五加科、紫草科、菊科、龍膽科、葫蘆科、茄科、玄參科、天南星科等數十科。本文就近年來藥用植物原生質體的制備、培養、融合以及植株再生進行綜述，為今后藥用植物原生質體培養的研究尋求切入點和突破點，提供新的研究方法和有力的論證依據。

1 原生質體的分離

原生質體分離是進行原生質體培養的第1步，直接影響原生質體培養能否成功。其中，原始材料的生理狀態，原生質體的分離、預處理方法以及游離純化方法等都是影響原生質體分離的重要因素。原生質體的分離方法主要有機械法和酶解法2種。機械法存在產量低等缺陷，因此多采用酶解法進行原生質體的分離。

1.1 原始材料的選擇

原始材料及其生理狀態對原生質體的制備及其活力有很大的影響[6]。生長旺盛、生命力強的組織和細胞是獲得高活性原生質體的關鍵，并對原生質體的復壁、愈傷組織的形成以及植株再生有重要的影響。原生質體分離的原始材料有很多，只要選用的酶類型及用量合適，就可以在植物的任何部位獲得游離的原生質體[2]。據有關原生質體培養的報道，葉片是分離原生質體試驗中常用的原始材料[7]。張曉麗等以青天葵新鮮葉片為試驗材料獲得制備青天葵原生質體的理想條件與參數[8]。愈傷組織和懸浮細胞生長迅速穩定，受環境條件影響比較小，更易獲得大量高質量的原生質體。但是，長期培養的愈傷組織和懸浮細胞容易引起植株喪失再生能力，這就須要選擇胚性狀態的細胞團，這是再生植株所必需的[9-10]。同時，基因型也會影響植物原生質體的培養，不同基因型分離得到的原生質體產量和活力差別很大[11]，并且對原生質體的植株再生也有一定的影響[12]。

1.2 原始材料的預處理

一些研究表明，材料的預處理對保持原生質體的完整性及提高原生質體產量有積極的作用。張曉麗等用13%甘露醇溶液預處理青天葵葉片1 h，獲得大量的原生質體[8]。王鵬凱等以北美鵝掌楸的懸浮細胞和組培苗葉片為材料，用含有0.1% 2-嗎啉乙磺酸（MES）和0.6 mol/L甘露醇的Cell Protoplast Wash （60M-CPW）溶液25 ℃預處理 1 h，結果顯示原生質體產量明顯提高[13]。于相麗等以洛陽紅牡丹葉片為材料制備原生質體，在蔗糖濃度為0.3 mol/L的溶液中預處理0.5 h的效果最好[14]。但是，并不是所有的原生質體分離都需要經過預處理，要根據不同的情況而定。

1.3 原生質體的分離方法

藥用植物游離原生質體常用的酶有纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、離析酶等，不同植物材料選用哪種酶較好取決于所用細胞和組織的來源。不同種類酶的混合使用和精確的酶解溫度和酶解時間的設置，可以得到較好的酶解效果[15-16]。近年來，開發一種微生物型的纖維素酶和果膠酶用于原生質體分離逐漸成為討論的焦點[17]。

滲透壓是影響原生質體游離的一個重要因素。滲透壓過低，原生質體缺乏細胞壁的保護，往往會出現破裂的情況。有研究表明，微高的滲透壓有利于原生質體維持穩定的形態[18]。滲透壓穩定劑是酶液的重要組成部分，應當引起足夠的重視。藥用植物原生質體分離環境中常用的滲透壓穩定劑為甘露醇和山梨醇[19-20]，甘露醇由于在試驗中的降解性小于山梨醇而被認為是目前最適合的滲透壓穩定劑。

1.4 原生質體游離基純化方法

原生質體游離后的提純方法常用的有漂浮法和沉降界面法，其中沉降界面法使原生質體集中在兩相界面，操作簡單，但是容易造成原生質體損傷；漂浮法在重復漂浮洗滌純化的過程中對原生質體的損傷較小，但是容易混進一些不需要的原液，影響漂浮純化效果，這就須要嚴格控制離心力[21]。

2 原生質體的培養

2.1 培養基

在藥用植物原生質體的培養中，常用的培養基有改良的MS、B5、KM8P、6，7-V、V-KM等培養基[22-25]，培養基的pH值一般為5.6～5.8。無機鹽是構成培養基的主要成分，一般Ca2+和NH+4對原生質體培養效果影響較大，且較高濃度的Ca2+有利于原生質體培養[26]。馬鋒旺等在原生質體培養中發現，高濃度的NH+4能抑制原生質體分裂[27-28]。原生質體洗液（CPW）中鹽離子的濃度和種類對原生質體細胞膜的穩定性也有一定的影響，試驗中應注意[29]。

一定水平的滲透壓可以保持原生質體的正常形態，使原生質體的正常生理功能得以進行，培養基中的碳源和滲透劑在原生質體培養中有重要的作用。衛志明等研究發現，使用葡萄糖可以提高懸鈴木葉肉原生質體的植板率[30]。林順權等在對枇杷原生質體的研究中發現，10%葡萄糖+5%山梨醇是所有試驗處理中最合適的碳源兼滲透劑[31]。endprint

2.2 培養方法

原生質體常用的培養方法包括液體淺層培養、固-液雙層培養、瓊脂糖包埋及看護培養等方法，目前應用最廣泛的是固-液雙層培養。范小峰等以南蛇藤胚性愈傷組織為材料分離原生質體，采用液體淺層靜置培養并取得了較好的原生質體培養效果[32]。秦曉杰等在胚性愈傷組織誘導培養基中進行原生質體的懸滴培養、液體培養等不同培養方式的研究，結果表明看護培養是最佳培養方法[22]。這些常用的原生質體培養方法同樣適用于藥用植物原生質體培養。

不同類型的藥用植物應根據實際情況采用不同的培養方式，一些植物也可采用多種培養方式聯合培養。其中，五加科、天南星科等較適合液體淺層和固-液雙層的聯合培養方式[24，33]，菊科、傘形科的植株較適合固體的培養方式[2，34]，茄科、玄參科植株較適合液體淺層培養方式[35-36]。

3 原生質體的融合

由于植物原生質體沒有細胞壁的限制，它為體細胞遺傳研究和作物改良提供了許多方便[37]。傳統的有性雜交存在遠緣雜交不親和、雙親花期不遇、雌（雄）不育等難以克服的障礙，嚴重阻礙了雜交技術在植物育種中的應用。由于分離的原生質體無細胞壁，可以用物理或化學方法誘導融合。利用植物原生質體進行細胞融合和體細胞雜交，可以克服有性雜交遇到的障礙。

自 Carlson等在 1972 年獲得第1株煙草體細胞雜種植株以來[38]，原生質體融合技術在藥用植物中已廣泛應用。早期原生質體融合的方法主要有硝酸鈉法、高濃度Ca2+高 pH值法、PEG（聚乙二醇）法、PEG-高濃度Ca2+高pH值法、電融合法及聚集微束激光法等，目前廣泛使用的是PEG-高濃度 Ca2+高 pH 值法[39-40]和電融合法[41-42]。但是，PEG-高濃度 Ca2+高 pH值法存在融合頻率低的弱點。Chen等用該方法進行原生質體融合，融合頻率約45%[43]。近年來一些研究者發現，加入二甲基亞砜（DMSO）可以有效提高融合頻率[44]。電融合法操作簡單、快速，融合同步性好，還可以避免化學藥劑的毒害作用，被大家普遍接受。

4 原生質體的再生

在藥用植物原生質體培養中，因為原生質體培養的穩定性和可重復性差且經驗性很強，所以由原生質體獲得愈傷組織的實例很多，但是成功獲得原生質體再生植株的案例很少。目前，我國從藥用植物的原生質體培養和花藥培養中獲得完整植株的物種有前胡、防風、決明子、黨參、石刁柏、枸杞、毛葉曼陀羅等[45]。原生質體再生植株的途徑通常有3種：由細胞團形成愈傷組織，然后再分化成植株；直接形成胚狀體，再發育成植株；由細胞團形成的愈傷組織先分化成胚狀體，然后發育成植株[1]。據目前一些研究結果來看，大多數植物再生植株以誘導器官發生途徑較多，而五加科和傘形科植物的最佳途徑是誘導體胚的發生[2]。

5 結論

近年來，國內外廣泛地開展了植物原生質體的研究工作，植物原生質體培養和融合取得了突破性進展，主要表現在通過原生質體獲得再生植株的種類不斷增加。其中，藥用植物已經從原來不能雜交的植物胡蘿卜和人參、曼陀羅和顛茄、煙草和龍葵等獲得雜種植株。

雖然藥用植物原生質體培養和融合取得很大進展，但也存在一些缺陷，如再生植株遺傳性狀的穩定性差；雜種植株發生變異的規律尚不明確；缺乏完整的藥用植物原生質體培養體系，技術體系基本借鑒于其他植物且相對落后。這些都是藥用植物原生質體研究以后需要重點解決的問題。

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