獐奶氨基酸和脂肪酸含量分析及奶胃微生物分離鑒定

趙國忠,胡陸軍,王金美,姚云平,郝光飛,陳 衛,*

(1.江南大學食品學院,食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122;2.無錫市動物園管理處,江蘇無錫 214086)

獐奶氨基酸和脂肪酸含量分析及奶胃微生物分離鑒定

趙國忠1,胡陸軍1,王金美2,姚云平1,郝光飛1,陳 衛1,*

(1.江南大學食品學院,食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122;2.無錫市動物園管理處,江蘇無錫 214086)

獐奶是幼獐的奶胃形成獐寶的基本物質,獐的奶胃是形成獐寶的主要場所。為進一步研究獐寶的體外合成機制,本文采用高效液相色譜和氣相色譜法測定了獐奶中氨基酸和脂肪酸含量。并通過傳統微生物分離手段對獐的奶胃微生物進行了分離鑒定。通過測定發現,獐奶中的水解氨基酸含量是牛奶的2.73倍。獐奶中絲氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸等游離氨基酸的含量高于牛奶中的含量,谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和丙氨酸的含量卻低于牛奶中的含量。獐奶中硬脂酸和亞油酸含量為牛奶的2倍多。通過對獐的奶胃微生物的分離和16S rDNA手段鑒定獲得20種細菌,這些細菌主要為動物類乳桿菌、腸桿菌和腸球菌類,這些細菌對促進“獐寶”形成起一定的作用。

獐,氨基酸,脂肪酸,細菌

獐為鹿科動物,分布于中國長江沿岸和朝鮮,文獻中記載的地點多為江蘇省無錫、鎮江及蘇州。獐,無角,成年獐體長約1米,四肢粗壯發達,耳朵相對較大,尾巴很短,毛多為棕黃色、灰黃色,毛粗而且脆,上犬齒發達,雄性獐齒尤其長而且大,約5 cm。獐生性膽小,動作靈敏,受驚擾時狂奔如兔。獐渾身是寶,幼獐吮吸獐奶后在胃中凝結而成的乳白色奶塊,俗稱“獐寶”,是一種名貴藥材,具有增加胃液分泌量和促進胃蛋白酶排出的作用,主治小兒疳積等消化不良癥狀。對促進兒童發育、提高智力和補益身體有較好作用,對中老年有提高抵抗力之功效。獐寶中免疫蛋白質含量約40%,含有多種微量元素[1],17種氨基酸含量占39.6%,谷氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸和賴氨酸含量尤其高。動物實驗也發現,獐寶對于提高鼠胃蛋白酶的活力,提高鼠血清胃泌素含量及小腸蠕動有很好的作用[2-4]。

獐屬于國家二級保護野生動物。目前,國內已經建立了許多專門飼養獐的基地,靠人工養殖,科學的“活體取寶”,既保護了物種,又能保證獐寶的質量,大大提高了獐寶的產量[5]。獐寶由獐乳而來,但是獐乳卻沒有獐寶的功效。獐乳經過小獐奶胃各種消化酶及微生物的作用以后,即賦予如此功效,可見小獐奶胃中的微生物起著至關重要的作用[6]。如果能實現小獐奶胃微生物的體外培養,在體外條件下實現獐寶的合成,那么對于減輕獐痛苦和提高獐寶產量將會有巨大的作用。本文對獐乳的氨基酸和脂肪酸含量進行了比較分析,并且對獐奶胃微生物進行了篩選鑒定,為獐寶形成的理論研究提供了科學的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

獐奶 采自無錫市陽山鎮;牛奶 購于無錫天姿乳業。

配置培養基、脂肪酸提取所用試劑 均為市售分析純;17種氨基酸標品和脂肪酸標品 均為色譜純;Taq酶、三磷酸脫氧核糖核苷(deoxyribonucleoside triphosphate,dNTP) 購自Tiangen公司。

氨基酸專用高效液相色譜儀 美國Agilent公司;GC氣相色譜儀 日本島津公司;BX51光學顯微鏡 日本OLYMPUS公司;瓊脂糖凝膠電泳儀 美國Bio-Rad公司;電泳槽 北京市六一儀器廠;凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 氨基酸分析樣品處理 游離氨基酸:取獐乳1 mL 10%三氯乙酸等體積混合,放置1 h,用雙層濾紙過濾,取濾液1 mL于1.5 mL離心管中,10000 r/min離心10 min后取上清液500 μL于Agilent專用樣品瓶內,備用[7]。

水解氨基酸:稱樣(準確稱取1.0 g樣品放入水解管中),然后水解(加入1 mL濃鹽酸和6 mL的4 mol/L鹽酸,邊抽真空邊封管,封好后的水解管統一放入設定溫度為110 ℃的烘箱,水解22 h),定容(水解液用25 mL容量瓶定容,然后用兩層濾紙過濾,去濾液1 mL于25 mL小燒杯中,放入真空干燥器中過夜干燥),蒸酸、取樣(取出蒸干后的小燒杯,加入0.02 mol/L鹽酸,靜置1 h后,用玻璃棒攪拌后直接倒入1.5 mL離心管內,10000 r/min離心10 min后取上清液500 μL于Agilent專用樣品瓶內,備用)[8]。

1.2.2 氨基酸分析 色譜柱:(250 mm×4.6 mm),5 μm ODS HYPERSIL;柱溫:40 ℃;流動相:A相:稱取8.0 g結晶乙酸鈉于1000 mL燒杯中,加入1000 mL水攪拌至溶解,再加入225 μL三乙胺,攪拌并滴加5%醋酸,將pH調到7.20±0.05,加入5 mL四氫呋喃,混合后備用;B相:稱取8.0 g結晶乙酸鈉于800 mL燒杯中,加入400 mL水攪拌至溶解,滴加2%醋酸,將pH調到7.20±0.05,將此溶液加入800 mL乙腈和800 mL甲醇混合備用[7]。

1.2.3 脂肪酸提取 取1 mL樣品于瓶1中,加入50 μL C17∶0的內標,加入1 mL 10%的HCl-甲醇溶液、0.5 mL正己烷,振蕩混勻,60 ℃,3 h,期間每隔0.5 h振蕩一次。然后,加入1 mL正己烷,1 mL飽和NaCl,振蕩混勻,3000 r/min離心3 min,取上清液于瓶2中。重復上一步,向瓶1中加入1 mL正己烷,1 mL飽和NaCl,振蕩混勻,3000 r/min離心3 min,取上清液于瓶2中。然后N2吹干,加入1 mL正己烷溶解,備用[9]。

1.2.4 脂肪酸分析 用氣相色譜進樣針吸取20 μL提取的脂肪酸樣品,采用島津公司的氣相色譜儀AOC-20i測定,色譜柱條件:DB-WAX(30 m×0.32 mm,0.25 μm;美國Agilent公司);氫火焰離子(FID)檢測器檢測;選用氮氣為載氣,流量為2 mL/min,采用分流方式進樣1 μL,分流比15∶1,進樣口溫度為240 ℃;升溫程序:120 ℃保持30 min,以5 ℃/min升至190 ℃,再以1 ℃/min升到210 ℃,保持3 min[9]。

1.2.5 微生物分離 用100 mL生理鹽水清洗獐的奶胃,收集清洗液作為樣品。取10 mL樣品作為原液,分別稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6濃度溶液。將每個稀釋度溶液各以100 μL平均點加入到MRS平板和PDA平板上面,小心地用滅過菌的涂布器涂干。倒置于37 ℃和30 ℃恒溫培養箱中,15～24 h以后取出觀察,記錄長出的單菌落的不同形態,并用無菌牙簽挑出單一菌落的菌株,鏡檢,三區劃線反復3次,37 ℃和30 ℃恒溫過夜培養,并對其進行革蘭氏染色鏡檢。鏡檢以后的菌株分別接種于MRS或PDA液體管中進行傳代培養,甘油管保存于-80 ℃冰箱,備用。

1.2.6 微生物鑒定 采用16S rDNA序列比對的方法,先將甘油管保存菌株過夜培養活化2次,離心收集菌體物質。提取該菌株的基因組DNA或直接采用菌落PCR測定。本實驗的16Sr DNA的聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)的引物是采用通用引物序列:上游引物27F的序列為:5′-AGAGTTTGATCCTGGCCTCA-3′,下游引物1492R的序列為:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。按照PCR說明書的步驟進行PCR。該反應體系為50 μL:10×buffer 5 μL;dNTPs 5 μL;上游引物(10μmol/L)0.5 μL;下游引物(10 μmol/L)0.5 μL;模板DNA 1.5 μL;dd H2O 37 μL;Taq DNA聚合酶(250 U)0.5 μL。PCR擴增條件為:95 ℃ 5 min;然后95 ℃ 10s;55 ℃ 30s;72 ℃ 1 min,進行25個循環,最后72 ℃延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測其產物純度,條帶大小為1500 bp左右。送上海桑尼公司測序,測序結果在NCBI上的Blast功能模塊進行物種比對,找出與其相似度最高的種屬[10]。

2 結果與分析

2.1 牛奶與獐奶氨基酸含量的比較

表1 牛奶與獐奶氨基酸含量

游離氨基酸能賦予奶類“鮮”的特點,使其味道更加誘人,直接影響其品質。本文通過測定牛奶與獐奶中的游離氨基酸的量,發現獐奶中游離氨基酸總量比牛奶中的少,谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸等氨基酸含量都較低(表1)。谷氨酸和天冬氨酸具有鮮味,是最主要的鮮味氨基酸。甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸能賦予甜味,是主要的甜味氨基酸[11]。獐奶中游離的絲氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸都比牛奶中的高出很多。其中半胱氨酸是牛奶中的8倍多。絲氨酸為牛奶蘇氨酸具有一種焦糖的風味[12],半胱氨酸為一種含硫氨基酸,具有可口的肉香[12]。游離氨基酸不僅能直接賦予食品以滋味,而且它也是其它風味物質的前體物質,氨基酸代謝形成的物質可以與脂類等物質進行反應。

通過對水解氨基酸的測定,不僅能檢測奶中蛋白質含量的多少,而且也能了解各種氨基酸所占的比例。獐奶總的水解氨基酸含量是牛奶的2.73倍,并且幾乎各種氨基酸含量都是牛奶的2倍以上(表1)。獐奶中氨基酸含量比牛奶高許多,可見其營養價值很高。

2.2 牛奶與獐奶脂肪酸含量的比較

脂類具有重要的代謝生理功能,脂肪酸是人體必需的一種營養素。脂肪酸可以促進細胞膜的形成,組成細胞重要的結構單元,同時它也是構成機體重要的信號物質以及能量的來源之一[13]。脂肪酸的測定以C17∶0作為內標,氣相色譜檢測后發現,牛奶(圖1)和獐奶(圖2)中硬脂酸和亞油酸的含量差別最大。經過比較發現,牛奶中硬脂酸(C18∶0)含量為90.93 μg/mL,亞油酸(C18∶2)含量為77.43 μg/mL。獐奶中硬脂酸含量為193.96 μg/mL,亞油酸含量為168.82 μg/mL,硬脂酸和亞油酸含量都為牛奶的2倍多。亞油酸為多不飽和脂肪酸,是一種人體所必需的脂肪酸,對于降低膽固醇和預防心肌梗塞具有一定作用[14]。

圖1 牛奶中脂肪酸色譜圖Fig.1 Chromatogram of fatty acids in milk注：1.硬脂酸(C18∶0);2.亞油酸(C18∶2)，同2同。

圖2 獐奶中脂肪酸色譜圖Fig.2 Chromatogram of fatty acidin the Hydropotesinermis milk

2.3 幼獐奶胃微生物的分離

表2 菌株序列比對結果

獐有兩個胃,一個草胃,另一個為奶胃(圖3)。奶胃在幼獐吃奶時期起重要作用,奶胃依靠大量的微生物及消化酶作用于獐奶,是獐寶形成的重要場所。MRS培養基和PDA培養基上生長的菌落圓潤光滑,大小不一(圖4)。鏡檢觀察發現有一部分菌為桿狀,革蘭氏染色成紫色的菌有可能為乳酸菌,還有一些菌成球形,這些菌的菌落都不大,可以初步推斷為細菌。PDA平板上生長的菌落也不大,光滑成圓形,也為細菌。

圖3 獐草胃和奶胃Fig.3 Grass stomach and milk stomach of Hydropotesinermis

圖4 Hydropotesinermis swinhoe微生物在MRS培養基和PDA培養基的菌落形態Fig.4 The colonial morphology onMRS medium and PDA medium

2.4 幼獐奶胃微生物的鑒定

挑選各個形態大小不同的白色菌落在MRS平板和PDA平板上三區劃線。連續劃線3次,盡可能保證所挑取的菌落為單一微生物。提取DNA后,擴增該細菌的16S rDNA,測序驗證后與NCBI數據庫比對,序列相似度均大于99%,得到結果如表2所示。從表中可以得出,乳桿菌和一些球菌種類最多,這些乳桿菌從命名來看都屬于動物來源,有別于植物乳桿菌。乳桿菌的存在不僅能抑制有害菌的生長,產生多種抑菌物質[15],而且可以產生消化酶,促進獐寶的形成。腸球菌和腸桿菌在獐奶胃中數量也較多。在獐寶形成的過程中也起到一定的作用。

3 結論

本文對獐奶和牛奶中的游離氨基酸、水解氨基酸及脂肪酸含量進行了比較分析。比較發現,獐奶中的游離氨基酸(絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸)含量大于牛奶中游離氨基酸含量的2倍。其中半胱氨酸含量高達2.37×10-4mg/mL,與牛奶中的游離氨基酸形成鮮明對比,是牛奶中的8.66倍。水解氨基酸各個氨基酸含量都超過牛奶中的含量,總氨基酸含量為牛奶中的2.73倍。另外,獐奶中的硬脂酸和亞油酸含量為牛奶中的2倍多,增加比較明顯。這些數據都說明獐奶中的營養成分物質要高于牛奶。此外,經過對獐奶胃中微生物的分離鑒定,我們獲得了20種來源的微生物。其中,動物類的乳桿菌占大多數,另外還有腸桿菌,腸球菌等細菌,在獐寶形成的過程中提供了獨特的胃酸環境,其分泌的代謝產物有效促進了獐寶的形成。本文的研究,為盡快實現獐寶的體外合成創造了條件。

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Analysis of amino acid and fatty acid in theHydropotesinermismilk and identification of the microorganism in the milk stomach

ZHAO Guo-zhong1,HU Lu-jun1,WANG Jin-mei2,YAO Yun-ping1,HAO Guang-fei1,CHEN Wei1,*

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Zoo Management Office of Wuxi,Wuxi 214086,China)

Hydropotesinermismilk can be synthesized toHydropotesinermisswinhoe in theHydropotesinermismilk stomach. In this study,the contents of amino acid and fatty acid in milk andHydropotesinermismilk were investigated and compared by high performance liquid chromatography and gas chromatography,and the microorganism in theHydropotesinermismilk stomach were also separated for exploring the synthesis mechanism ofHydropotesinermisswinhoe. The content of hydrolysis amino acid inHydropotesinermismilk was 2.73 times more than milk. The contents of free amino acids(serine,threonine and cysteine)inHydropotesinermismilk were more,but the free amino acids(glutamic acid,aspartic acid,glycine and alanine)were less than milk. The contents of stearic acid and linoleic acid inHydropotesinermismilk were 2 times more than milk. In addition,20 kinds of bacterium including animalLactobacillus,EnterobacterandEnterococcuswhich play roles in the formation ofHydropotesinermisswinhoe were separated and indentified by 16S rDNA blasting.

Hydropotesinermis;amino acid;fatty acid;bacterium

2014-09-22

趙國忠(1983-)，男，博士研究生，講師，研究方向：食品微生物學，E-mail:zgzjiangnan@163.com。

*通訊作者:陳衛(1966-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物技術，E-mail:chenwei66@jiangnan.edu.cn。

國家自然科學基金青年基金項目(31401682)；江南大學2013年校級本科教育教學改革研究立項項目(JGB2013071)。

TS252.54

A

1002-0306(2015)15-0074-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.007