四川泡菜中植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶基因克隆與表達(dá)

董 維,陳安均,韓國(guó)全,蒲 彪,羅 惟,侯曉艷

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川雅安 625014)

四川泡菜中植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶基因克隆與表達(dá)

董 維,陳安均*,韓國(guó)全,蒲 彪,羅 惟,侯曉艷

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川雅安 625014)

目的:對(duì)植物乳桿菌中亞硝酸鹽還原酶基因進(jìn)行克隆并表達(dá),并測(cè)定酶的活力。方法:根據(jù)GenBank中亞硝酸鹽還原酶(NIR)基因序列,設(shè)計(jì)引物。提取植物乳桿菌的DNA,采用PCR技術(shù)擴(kuò)增nir基因,TA克隆構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒pMD19-nir,分析其核苷酸序列同源性。通過雙酶切連接到表達(dá)載體pET-32a(+)中,獲得重組表達(dá)載體pET-32a-nir,構(gòu)建成功后轉(zhuǎn)化到E.coliBL(DE3)中進(jìn)行表達(dá)研究。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),得重組蛋白,超聲波破碎,提取粗酶液,測(cè)定酶活力。結(jié)果:克隆的目的基因序列長(zhǎng)度為1638 bp。獲得重組蛋白分子量為80 ku,酶活力為4.2 U/mg。結(jié)論:成功克隆了植物乳桿菌中的亞硝酸鹽還原酶基因,成功的導(dǎo)入到E.coliBL(DE3)中,表達(dá)產(chǎn)物有酶活。

亞硝酸鹽還原酶，克隆,基因表達(dá),植物乳桿菌

四川泡菜是以新鮮蔬菜為原料,在以乳酸菌為主要菌群的作用下經(jīng)厭氧發(fā)酵而形成的一種發(fā)酵食品[1-2]。泡菜對(duì)降低人體內(nèi)的膽固醇含量、預(yù)防高血壓等疾病有一定的作用[3-4]。然而在新鮮蔬菜發(fā)酵過程前期會(huì)出現(xiàn)一個(gè) “亞硝峰”[5-6],有的遠(yuǎn)超過我國(guó)腌制食品中30 mg/kg亞硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)[7]。而亞硝酸鹽的危害主要是使血紅蛋白失去了攜帶氧的能力[8],并且亞硝酸鹽容易生成有很強(qiáng)的致癌作用的亞硝胺化合物[9]。大量文獻(xiàn)報(bào)道出乳酸菌具有降解亞硝酸鹽的能力[10-13],其中杜曉華[14]等從四川泡菜中篩選出降解亞硝酸鹽乳酸菌,其降解率高達(dá)90%。

隨著分子技術(shù)的發(fā)展,運(yùn)用基因克隆的技術(shù),通過對(duì)亞硝酸鹽還原酶保守序列進(jìn)行分析等,設(shè)計(jì)引物,pcr擴(kuò)增亞硝酸鹽還原酶基因,連接轉(zhuǎn)化,并導(dǎo)入大腸桿菌中,誘導(dǎo)表達(dá),產(chǎn)生亞硝酸鹽還原酶,從而來降解亞硝酸鹽,為進(jìn)一步的亞硝酸鹽還原酶工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院提供;TaKaRa T-Vector pMD 19(Simple)克隆載體,pET-32a(+)表達(dá)載體購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;大腸桿菌DH5a,大腸桿菌BL21(DE3),TIANamp Bacteria DNA Kit細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,DL2000 DNA Marker,普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒,限制性內(nèi)切酶Bgl II,Xho I,2x Taq PCR Master-Mix購(gòu)自北京TIANGEN生物公司等。

DNP-9126型恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;WH-2微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司;BCD-216TXN海爾冰箱 青島海爾有限公司;ZD-85氣浴恒溫振蕩器 四川新科儀器有限公司;冷凍高速離心機(jī) Thermo SCIENTIFIC;C1000 Thermal Cycler PCR儀 美國(guó)Bio-RAD公司;SUB-CELL GT小型水平電泳槽 美國(guó)Bio-RAD公司;Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)Bio-RAD公司;DYCZ-240型電泳儀及電源 北京市六一儀器廠;UV-2102PCS型紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯上海儀器有限公司。

1.2 菌種DNA的提取

利用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取植物乳桿菌的DNA。

1.3 nir基因的克隆

參考LactobacillusplantarumWCFS1全部基因序列設(shè)計(jì)引物,F1上游引物:5′-CCAGATCTGGGT ACCATG AGTCAAAGCTTATGGCAA-3′(下劃線為Bgl II的酶切位點(diǎn)),R1下游引物:5′-GCGGCCGCA CTCGAGCATTAATTCCGT ACACT GTTTGC-3′(下劃線為XhoI的酶切位點(diǎn))。PCR擴(kuò)增體系(25 μL):dd H2O 9.5 μL,Mix 12.5 μL,,植物乳桿菌DNA 1 μL,上游引物、下游引物各1 μL,混勻。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性45 s,56 ℃退火45 s,72 ℃延伸90 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。吸取5 μL PCR產(chǎn)物,通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[20]。在紫外燈下切下目的片段,利用膠回收試劑盒回收目的片段,與T-Vector pMD19(simple)載體連接,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中,將轉(zhuǎn)化菌涂布含Amp 100,24 mg/mL IPTG和20 mg/mL X-Gal的LB平板上[21],篩選陽性克隆子,并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。提取重組質(zhì)粒DNA,進(jìn)行雙酶切鑒定。將鑒定正確的克隆子送到華大基因進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序的結(jié)果用DNAStar軟件分析并于GenBank中發(fā)表的基因進(jìn)行序列比對(duì)。

1.4 重組質(zhì)粒pET-32a-nir的構(gòu)建

將克隆的質(zhì)粒和質(zhì)粒pET-32a分別用限制性內(nèi)切酶切開,酶切體系BamH I 1 μL、XhoI 1 μL、緩沖液2 μL、重組質(zhì)粒8 μL、ddH2O 8 μL、總體積20 μL,水浴37 ℃反應(yīng)4 h,純化回收,用DNA快速連接試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng),把轉(zhuǎn)化液涂布于相應(yīng)的LB的培養(yǎng)基中,同時(shí)以空載體為對(duì)照。挑取陽性克隆子進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),提取DNA,并進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定[20-21]。并把鑒定正確的克隆子送華大基因測(cè)序。

1.5 重組菌株在大腸桿菌中的表達(dá)

將構(gòu)建好的表達(dá)菌株接種到LB/Amp液體培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h,然后分別按1%的菌液量接種于含有50 mL LB/Amp液體培養(yǎng)基的三角瓶中,37 ℃振蕩培養(yǎng)6 h(菌液OD600達(dá)到0.4～0.6)時(shí)[21],加入IPTG使最終濃度為1 mmol/L,37 ℃誘導(dǎo)時(shí)間4 h行誘導(dǎo)表達(dá);同時(shí)以空載體和未誘導(dǎo)作對(duì)照。取樣10 mL,12000 r/min離心2 min,棄去上清液,沉淀加入菌體沉淀重懸于5 mL預(yù)冷的PBS緩沖液(pH7.4)中,超聲裂解3 min,每次3 s,間隔5 s,功率400 W。然后 12000 r/min,4 ℃,離心20 min,上清液為粗酶液[20-21],進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè),記錄并分析結(jié)果。

1.6 重組菌株酶活的測(cè)定

用GENMED細(xì)菌亞硝酸鹽還原酶總活性比色法定量檢測(cè)試劑盒來測(cè)定酶活,其原理:基于底物亞硝酸鹽,在人工電子供體還原型甲基紫精的參與下,受到亞硝酸鹽還原酶的催化產(chǎn)生氨或一氧化氮,同時(shí)還原型甲基紫精轉(zhuǎn)化為氧化型甲基紫精,通過其吸收峰值的變化(600 nm波長(zhǎng)),來定量分析亞硝酸鹽還原酶的總活性[22],步驟和公式詳見試劑盒說明書。酶活測(cè)定的數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行整理,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因擴(kuò)增及序列分析

以植物乳桿菌DNA為模版,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出nir目的基因,用1%瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果如圖1:可以明顯看出1,2,3目的基因擴(kuò)增的片段在1200 bp到2000 bp之間有單一的條帶,條帶大小與預(yù)期目的片段大小一致,而4是陰性對(duì)照沒有條帶。

圖1 nir目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定Fig.1 Electrophoresis of PCR amplificationof the targeted nir gene注:M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1,2,3為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;4為陰性對(duì)照。

2.2 T克隆的雙酶切鑒定及序列比對(duì)

將構(gòu)建好的T克隆陽性菌株,擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒DNA后,經(jīng)PCR鑒定正確后,再用雙酶切鑒定,把酶切后的產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測(cè)顯示:從圖2中可以明顯看出,重組質(zhì)粒明顯被切分為兩個(gè)片段,在2000～3000 bp之間的是T-Vector pMD19基因片段,而在1200～2000 bp之間的是nir目的基因片段,而對(duì)照組(沒有導(dǎo)入目的片段)則只有一個(gè)條帶,即T-Vector pMD19被酶切的片段。這與預(yù)期酶切產(chǎn)物片段大小相符。

圖2 T克隆的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of T plasmidby double restriction digestion注:M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1,2為雙酶切產(chǎn)物;3為陰性對(duì)照。

把鑒定正確的陽性克隆子送去測(cè)序,測(cè)序結(jié)果經(jīng)軟件分析得出:nir基因的開放閱讀框堿基長(zhǎng)度為1638 bp,經(jīng)NCBI Blast的結(jié)果:與其它nir(JX434610.1)的最高同源性為99%,找到nir基因的核苷酸序列及編碼的氨基酸序列(如圖3)。證明本次實(shí)驗(yàn)成功克隆出nir基因。

圖3 nir基因的核苷酸序列及編碼的氨基酸序列Fig.3 The nucleotide sequences anddeduced amino acid sequences of nir genes注:下劃線部分為引物序列;方框?yàn)橄拗菩詢?nèi)切酶序列;斜體為非編碼序列。

2.3 重組質(zhì)粒pET-32a-nir的雙酶切鑒定

把構(gòu)建好的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定后,再雙酶切鑒定,電泳檢測(cè)結(jié)果如下(見圖4):1,2為重組質(zhì)粒(導(dǎo)入目的基因)的雙酶切產(chǎn)物,可以明顯看出重組質(zhì)粒被切分成兩個(gè)大小不同的條帶:在5000～7500 bp之間的是酶切后的pET-32a(+)基因片段,而在1000～2500 bp之間的nir基因片段。對(duì)照組3,4只存在pET-32a(+)基因片段,不存在目的基因片段。這與預(yù)期產(chǎn)物片段結(jié)果一致,把酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送去測(cè)序,對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析,結(jié)果表明成功構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-nir。

圖4 重組質(zhì)粒pET-32a-nir的雙酶切鑒定Fig.4 Double restriction enzyme digestionof recombinant plasmid pET-32a-nir注:M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1,2為重組質(zhì)粒的雙酶切;3,4為對(duì)照組。

2.4 重組菌株蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳檢測(cè)

把構(gòu)建好的重組表達(dá)菌株接種到LB/Amp的液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)5 h后,加入工作濃度為1 mmol/L的IPTG、37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h。取IPTG誘導(dǎo)后的菌液,離心獲得菌體,經(jīng)洗滌,破碎后取總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè),結(jié)果如圖5所示:

圖5 重組蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳檢測(cè)Fig.5 Electrophoresis of SDS-PAGEof the recombinant expression product注:M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn);1為空載;2為誘導(dǎo)表達(dá)菌株;3為未誘導(dǎo)表達(dá)菌株。

從圖5可以明顯看出,誘導(dǎo)表達(dá)的菌株總蛋白樣品中存在一條在66 ku和97 ku條帶之間的明顯條帶(即箭頭所指的條帶),而對(duì)照組中的空載和未誘導(dǎo)的表達(dá)菌株沒有條帶,利用在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)重組蛋白的分子量為80 ku,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值一致,從而證明構(gòu)建好的原核表達(dá)菌株能夠誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。

2.5 酶活力的測(cè)定結(jié)果

用細(xì)菌亞硝酸鹽還原酶活性檢測(cè)試劑盒對(duì)重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物、非誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物和空載的酶活性進(jìn)行測(cè)定。非誘導(dǎo)和空載的檢測(cè)結(jié)果顯示5 min內(nèi)OD600值沒有明顯變化,而重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的樣品則有明顯的變化(結(jié)果見圖6)。先用BCA蛋白定量算出不同樣品的蛋白樣品濃度,再根據(jù)公式算出重組表達(dá)菌株酶活力為4.2 U/mg(U=微摩爾亞硝酸鹽/分鐘)。

圖6 表達(dá)產(chǎn)物酶活測(cè)定Fig. 6 Enzyme activity of expression product

3 結(jié)論與討論

亞硝酸鹽還原酶存在于大量的植物和微生物中,但大多數(shù)為胞內(nèi)酶,在細(xì)胞外的效果不好,并且亞硝酸鹽還原酶是氧化還原酶,需要電子傳遞體的參與,從而限制了亞硝酸鹽還原酶的應(yīng)用[23]。本文從研究四川傳統(tǒng)泡菜中亞硝酸鹽的變化中,發(fā)現(xiàn)乳酸菌具有降解亞硝酸鹽的能力,張慶芳[13]等研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌降解主要分為酸降解和酶降解。其中有學(xué)者從乳酸菌中分離純化出亞硝酸鹽還原酶,并進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的研究[24]。實(shí)驗(yàn)所用的植物乳桿菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng),離心,破壁得到粗酶液,用鹽酸萘乙二胺法檢測(cè),初步認(rèn)定該菌株含有亞硝酸鹽還原酶的基因[22]。通過分子克隆技術(shù),構(gòu)建和表達(dá)了重組目的蛋白,并對(duì)該蛋白用細(xì)菌亞硝酸鹽還原酶總活性試劑盒進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的蛋白具有降解亞硝酸鹽的能力。從而證明克隆的亞硝酸鹽還原酶基因是正確的,也說明實(shí)驗(yàn)所用的植物乳酸菌確實(shí)含有亞硝酸鹽還原酶的基因。

重組表達(dá)的目的蛋白酶活力不高,需對(duì)重組表達(dá)菌株誘導(dǎo)表達(dá)的條件進(jìn)行分析,主要從誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度、溫度等方面進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)出來的粗酶液,重組蛋白質(zhì)的純化,并對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析,確定最佳酶活反應(yīng)條件,從而測(cè)定亞硝酸鹽還原酶的酶活力。

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Expression of nitrite reductase gene fromLactobacillusplantarumfrom Sichuan pao cai

DONG Wei,CHEN An-jun*,HAN Guo-quan,PU Biao,LUO Wei,HOU Xiao-yan

(College of Resources and Environment,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China)

Objective:To clone and the nitrite reductase gene(nir)fromLactobacillusplantarumand detect the enzyme activity. Methods:The primers were designed according to nir sequence in GenBank. The DNA fromLactobacillusplantarumwhich came from Sichuan pao cai was extracted. The nir gene was amplified by PCR,it was cloned into T vector pMD19. The recombinant plasmid was constructed for analyzing the sequence homology. The plasmid by double enzyme digestion was connected to the expression plasmid pET-32a(+). It was constructed the recombinant plasmid pET-32a-nir. The plamid was transformed intoE.coliBL(DE3)in order to express the research. The new host bacteria grew with IPTG induction,the cell was broken with ultrasonic. The crude enzyme was extracted and the enzyme activity was measured. Result:The purpose of cloned gene length was 1638 bp. A kind of recombinant protein with the molecular weight of 80 ku was obtained. The enzyme activity was 4.2 U/mg. Conclution:The nitrite reductase gene fromLactobacillusplantarumwas successfully cloned and transformed inE.coliBL(DE3),the expression product had enzyme activity.

nitrite reductase;clone;gene expression;Lactobacillusplantarum

2014-10-23

董維(1988-)，男，在讀研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏，E-mail：784292718@qq.com。

*通訊作者:陳安均(1970-)，男，博士，副教授，研究方向：園藝產(chǎn)品加工與貯藏，E-mail：591919465@qq.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31171726)；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD31B04)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)15-0143-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.022