穩定性同位素稀釋-超高效液相色譜串聯質譜法測定腐竹中的烏洛托品

徐 幸,張曉鳴,張 燕,舒 平,彭飛進

(1.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122;2.大理州質量技術監督綜合檢測中心,云南大理 671000)

穩定性同位素稀釋-超高效液相色譜串聯質譜法測定腐竹中的烏洛托品

徐 幸1,2,張曉鳴1,*,張 燕2,舒 平2,彭飛進2

(1.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122;2.大理州質量技術監督綜合檢測中心,云南大理 671000)

采用超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)和穩定性同位素稀釋技術,建立了測定腐竹中烏洛托品的分析方法。以乙腈為提取溶劑,向腐竹樣品中加入烏洛托品的穩定性同位素,經固相萃取柱凈化,采用HILIC色譜柱分離,目標物在UPLC-MS/MS的多反應監測(MRM)模式下,內標法定量。該方法在1～40 μg/L范圍內有良好的線性關系,相關系數為0.9996,方法定量限為2 μg/kg。在添加水平為2、10、30 μg/kg時,平均回收率為97.8%～101.5%,相對標準偏差(RSD)為1.9%～4.8%。本方法靈敏度高,準確度和重復性好,可為作為檢測腐竹中違法添加烏洛托品的方法。

穩定性同位素稀釋技術,超高效液相色譜-串聯質譜法,烏洛托品,腐竹

烏洛托品(Urotropine),化學名稱為1,3,5,7-四氮雜三環[3.3.1.1]癸烷,分子式為C6H12N4,常用于醫藥和化工領域[1],因其在酸性環境中會分解為甲醛而具有殺菌作用,常被用作防腐劑非法添加到食品中。因甲醛對人體的免疫功能以及消化系統有損害[2],早在2010年3月,中國就將烏洛托品列入食品中可能違法添加的非食用物質名單(第四批)[3]。但有監管部門已發現,部分生產者將烏洛托品非法添加到腐竹中,以延長其保質期。然而我國尚無檢測腐竹中烏洛托品的國家標準,僅有只適用于檢測動物源性食品的行業標準SN/T 2226-2008[4]。近年來,關于豆制品中烏洛托品的檢測方法已有文獻報道,主要有氣相色譜法[5]、液相色譜法[6]、激光拉曼光譜法[7]以及液質聯用法等[8-10],絕大多數都采用外標法來定量,而外標法的回收率不穩定,相對標準偏差較大,這將導致檢測數據的不準確。也有研究者用內標方法來定量,陸春良等[11]采用三聚氰胺作為內標對烏洛托品進行定量檢測,但兩者的化學性質并非完全一致,這也會使檢測數據不準確。因此,有必要建立一種更穩定可靠的檢測方法。

穩定性同位素稀釋技術用于食品檢測中,不僅能消除基質效應的影響,還可以使定量更準確[12-13]。本實驗采用同位素標記的烏洛托品作為內標,超高效液相色譜-串聯質譜法測定烏洛托品的含量,使得檢測方法的精密度和準確度都得到顯著提高。

表2 質譜分析參數

注:
注:*標注的為定量離子對。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烏洛托品、13C15N-烏洛托品標準品 購于Sigma公司,純度≥99%;色譜純甲醇、乙腈 購于Merck公司;乙酸銨 色譜純,購于Acros公司;所用其他試劑 均為分析純;實驗室用水 超純水;腐竹樣品 購于當地市場。

Cleanert PCX固相萃取小柱 規格為60 mg/3 mL,購于Agela Technologies公司;0.22 μm尼龍濾膜 購于安譜科學儀器有限公司;QTRAP 4500串聯質譜聯用儀、Ekspert ultraLC 100-XL超高效液相色譜儀 購于AB SCIEX公司;色譜柱為Phenomenex Luna 3μ HILIC,規格為100×2.0 mm,3μm;氮吹儀;超聲波清洗儀;AL204電子天平 購于Mettler toledo公司。

1.2 色譜-質譜分析條件

液相色譜操作條件:流速:0.6 mL/min;柱溫:40 ℃;進樣體積:5 μL;流動相:A為0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液,B為乙腈,梯度洗脫條件如表1。

表1 流動相的梯度洗脫程序

質譜離子源選用電噴霧正離子掃描模式(ESI+);多反應監測(MRM);離子源溫度為110 ℃;噴霧電壓為5500 eV;脫溶劑溫度為450 ℃;質譜分析參考條件參見表2。

1.3 標準溶液的配制和曲線繪制

準確稱取50 mg烏洛托品標準品與13C15N-烏洛托品標準品,用乙腈溶解并分別定容至50 mL,配制成1 mg/mL的標準物質儲備溶液,避光保存于4 ℃冰箱中。再逐級稀釋配制成標準工作液,將烏洛托品配制成1、2、5、10、20、30、40 μg/L的標準系列,13C15N-烏洛托品在每個濃度點的濃度都為10 μg/L,繪制標準曲線。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品的制備與提取 取有代表性樣品約100 g,用組織搗碎機搗碎,準確稱取2.5 g試樣(精確到0.001 g)于50 mL比色管中,加入100 μg/L的13C15N-烏洛托品標準溶液250 μL,用乙腈定容至25 mL,超聲提取15 min,用快速定性濾紙過濾,吸取10 mL濾液于40 ℃下氮吹濃縮近干后待凈化。

1.4.2 凈化 固相萃取柱使用前,先依次用3 mL甲醇、3 mL水活化,用2 mL甲醇溶解濃縮后的殘渣,并過固相萃取柱,再用3 mL水和3 mL甲醇淋洗固相萃取柱,棄去流出液,在15 mmHg以下減壓抽至柱體干涸,用5 mL 5%氨水-甲醇(v/v)洗脫并收集洗脫液,于40 ℃下氮氣吹干,準確加入1 mL乙腈溶解殘渣,經0.22 μm尼龍濾膜過濾,供液相色譜串聯質譜分析測定。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的選擇

采用針泵直接進樣的方式,分別對烏洛托品與13C15N-烏洛托品標準溶液進行母離子掃描,以確定目標物的準分子離子,兩種物質在正離子模式下靈敏度都比負離子模式下響應高。再分別以準分子離子m/z 141.1與m/z 151.3作為母離子,對其子離子進行全掃描,獲得了烏洛托品與13C15N-烏洛托品的質譜圖,如圖1、圖2所示,由質譜圖可以看出烏洛托品與13C15N-烏洛托品的特征離子,選擇其中響應較高,干擾較小的離子對作為多反應監測的離子對,SN/T2226-2008推薦的參考離子對為m/z 141.1/98.2,而實際檢測時發現盡管此離子對的響應較高,但樣品中的干擾也較大,故最終選擇了干擾較小的m/z 141.1/85.2作為參考離子對。在選定多反應監測的離子對后,對儀器的錐孔電壓、駐留時間以及碰撞能量等參數進行優化選擇,優化后的參數見表2。

圖1 烏洛托品的全掃描質譜圖Fig.1 Full scan mass spectrum of hexamethylenetetramine

圖2 13C15N-烏洛托品的全掃描質譜圖Fig.2 Full scan mass spectrum of13C15N-hexamethylenetetramine

2.2 色譜條件的優化

實驗考察了不同流動相對烏洛托品與13C15N-烏洛托品響應的影響,包括水-乙腈、5 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈、0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈等體系對質譜響應的影響,結果顯示采用0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈體系時烏洛托品與13C15N-烏洛托品的響應最強,因此,最終選擇0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈體系作為流動相,并對流動相的梯度洗脫程序進行了優化,優化后的條件見表1,圖3為烏洛托品與13C15N-烏洛托品在此條件下的多反應監測圖。

圖3 多反應監測色譜圖Fig.3 Multiple reaction monitoring chromatogram

2.3 樣品前處理條件的選擇

烏洛托品溶于水、乙腈、甲醇、乙醇等極性溶劑。因腐竹中含有大量蛋白質,選擇提取溶劑時,需兼顧沉淀蛋白與提取目標物的作用。有文獻報道[14-15]采用高氯酸或三氯乙酸的水溶液提取豆制品中的烏洛托品,但烏洛托品在酸性條件下易分解[3],因此本實驗選用非酸性溶劑乙腈、甲醇和乙醇等來提取烏洛托品,用乙醇提取時,烏洛托品的回收率低于50%,用乙腈和甲醇提取時回收率可達60%～70%,而乙腈提取的濾液色素含量較甲醇提取的低,最終采用了乙腈作為提取溶劑。

烏洛托品分子屬于多環叔胺結構,溶液呈堿性,在溶液中離子帶正電荷,因此需選擇能與目標物發生離子交換的陽離子交換柱,已有文獻報道混合型陽離子交換柱的回收率,較其他類型的陽離子交換柱好[4,8,14-15],也有文獻報道,采用PXA陰離子交換小柱作為凈化柱用于烏洛托品的檢測[3,9],但陰離子交換柱的凈化原理是雜質吸附于柱子中,目標物直接隨溶劑流出,如樣品中含有大量鹽類,不能保證收集的流出液中不含鹽類,此凈化效果將不及陽離子交換柱。結合烏洛托品的化學性質,參考文獻的報道,本實驗采用混合型陽離子交換固相萃取柱作為凈化柱。

2.4 方法的線性范圍與檢出限

烏洛托品的標準系列在濃度范圍為1～40 μg/L時,校準曲線的回歸方程為Y=0.1049X+0.0164(其中Y為烏洛托品對13C15N-烏洛托品的峰面積比,X為烏洛托品的濃度),線性相關系數為0.9996。根據10倍信噪比(S/N)計算該方法的定量限為2 μg/kg。同時考察了添加在腐竹中的烏洛托品MRM色譜圖,在目標物保留時間附近,無明顯干擾物存在。

2.5 方法回收率與精密度

分別向腐竹樣品中添加濃度為2、10和30 μg/kg三水平的回收率實驗,每個濃度重復測定6次,結果見表3,采用同位素內標法定量,其平均回收率在97.8%～101.5%范圍,相對標準偏差均小于5%,方法的準確度和精密度都符合分析要求,根據已有的文獻數據,采用液相色譜串聯質譜-外標法測定食品中的烏洛托品,汪輝等[8]測得的平均回收率在52.6%～118%范圍,相對標準偏差為7.1%～10.2%,馬雪濤等[14]測得的平均回收率在76.0%～83.6%范圍,相對標準偏差為2.7%～5.8%,回收率與內標法比較偏低,且精密度和穩定性也沒有內標法好,因此采用同位素內標法使得檢測結果更準確。此結果表明烏洛托品的絕對回收率難以達到100%,而穩定性同位素13C15N-烏洛托品與其化學性質類似,采用相同的提取凈化過程,兩者的絕對回收率較接近,當采用兩者的比值作為相對回收率時,精密度與準確度就得到顯著提高。

表3 烏洛托品在腐竹中的回收率和精密度實驗(n=6)

3 結論

本文建立了針對腐竹樣品中烏洛托品的檢測方法,采用乙腈提取腐竹中的烏洛托品,同時沉淀了基體中的蛋白,采用烏洛托品的穩定性同位素標記物作為內標,與常用的外標法相比較,同位素稀釋法的相對回收率較高,定量檢測結果也更準確。采用此法檢測了當地市場上的20個腐竹樣品,并未檢出烏洛托品。此方法操作簡便,準確度和精密度較外標法更好,可用于日常食品監管部門對腐竹中烏洛托品的監測。

[1]冼燕萍,陳立偉,羅東輝,等. UPLC-MS/MS測定腐竹和米粉中的烏洛托品[J]. 江南大學學報:自然科學版,2012,11(1):78-82.

[2]吳穎,張慧,崔芳,等. 超高效液相色譜串聯質譜法測定腐竹中烏洛托品的含量[J]. 食品工業科技,2014,35(17):298-300.

[3]中華人民共和國衛生部. 食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑名單(第四批)[R]. 2010-3.

[4]國家質量監督檢驗檢疫總局. SN/T 2226-2008 進出口動物源性食品中烏洛托品殘留量的檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法[S]. 北京:中國標準出版社,2008.

[5]黃國春. 氣相色譜法測定腐竹中烏洛托品含量的研究[J]. 廣西輕工業,2008(6):26-27.

[6]溫韜,徐強,張少梅,等. 高效液相色譜法測定腐竹中的烏洛托品[J]. 洛陽理工學院學報:自然科學版,2013,23(3):1-4.

[7]劉春偉,仲雪,馬寧. 激光拉曼光譜法快速測定腐竹中的微量烏洛托品[J]. 食品安全質量檢測學報,2012,3(4):306-308.

[8]汪輝,夏立新,彭新凱,等. 液相色譜-串聯質譜法快速測定食品中的烏洛托品[J]. 食品與機械,2013,29(3):72-78.

[9]周秀云,趙勇,俞婧. SPE-UPLC-MS/MS快速測定豆制品中的烏洛托品[J]. 河北省科學院學報,2013,30(1):64-68.

[10]張愛芝,張書芬,王全林,等.超高壓液相色譜-串聯質譜法測定腐竹、米線、年糕中的烏洛托品[J].食品安全質量檢測學報,2013,4(2):472-478.

[11]陸春良,劉娟,劉向農. 親水作用液相色譜電噴霧串聯質譜法測定米線中烏洛托品殘留[J]. 揚州大學學報:農業與生命科學版,2013,34(2):82-86.

[12]Lee SY,Kim BJ,Kim JK. Development of isotope dilution-liquid chromatography tandem mass spectrometry for the accurate determination of fluoroquinolones in animal meat products:Optimization of chromatographic separation for eliminating matrix effects on isotope ratio measurements[J]. Journal of Chromatography A,2013,(1277):35-41.

[13]Hon PYT,Chu PWS,Cheng CH,et al. Development of melamine certified reference material in milk using two different isotope dilution mass spectrometry techniques[J]. Journal of Chromatography A,2011,1218(39):6907-6913.

[14]馬雪濤,牛之瑞,馮雷,等. 離子交換固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定豆制品中烏洛托品殘留量[J]. 食品科學,2014,35(10):166-169.

[15]徐小民,黃百芬,任一平. 豆制品和粉干中烏洛托品的氣質聯用測定[J]. 食品安全質量檢測學報,2013(3):873-876.

Determination of urotropine in bean curd sticks by stable isotopic dilution-liquid chromatography with tandem mass spectrometry

XU Xing1,2,ZHANG Xiao-ming1,*,ZHANG Yan2,SHU Ping2,PENG Fei-jin2

(1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Dali Comprehensive Inspection Centre of Quality and Technical Supervision,Dali 671000,China)

A stable isotope dilution mass spectrometry technology for determination of urotropine in bean curd sticks by liquid chromatography with tandem mass spectrometry was developed. Isotopic urotropine was added to bean curd sticks as internal standard,and extracted with acetonitrile. Solid phase extraction(SPE)was applied to purify the sample. The separation was performed on a HILIC column. The analyte was determined by multiple reaction monitoring(MRM)mode with UPLC-MS/MS,and quantified by the internal standard method. The method showed good linear relationship in the range of 1～40 μg/L for urotropine,the correlation coefficient square was 0.9996. The limit of quantitation(LOQ)for sample was 2 μg/kg. The average recoveries were 97.8%～101.5% at spiked levels of 2,10,30 μg/kg. The relative standard deviation(RSD,n=6)was 1.9%～4.8%. This method is sensitive,accurate and reproducible. It is suitable for monitoring illegally added urotropine in bean curd sticks.

stable isotope dilution technology;ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry;urotropine;bean curd sticks

2014-11-13

徐幸(1983-)，女，在讀博士，工程師，研究方向：食品安全質量檢測，E-mail:amy911007@163.com。

*通訊作者:張曉鳴(1965-)，男，博士，教授，研究方向：食品安全質量控制，E-mail:xmzhang@jiangnan.edu.cn。

云南省衛生廳制修訂食品安全地方標準項目(云衛[2014]DB004)。

TS207.3

A

1002-0306(2015)15-0281-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.050