決明子提取物減輕2型糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注損傷

劉利兵，張海鋒

(1.西京學院 醫學護理教研室， 陜西 西安 710123； 2.第四軍醫大學 教學實驗中心，陜西 西安 710032)

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研究論文

決明子提取物減輕2型糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注損傷

劉利兵1*，張海鋒2*

(1.西京學院 醫學護理教研室， 陜西 西安 710123； 2.第四軍醫大學 教學實驗中心，陜西 西安 710032)

目的研究決明子提取物(SCE)對糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注(MI/R)損傷的影響。方法構建高脂飼料-鏈脲霉素誘導的2型糖尿病大鼠模型(HFD-STZ)，大鼠隨機分為對照組(Con)、SCE處理組(Con+SCE，每日灌胃給予SCE，10 mg/kg)、糖尿病組(DM)和糖尿病SCE處理組(DM+SCE)。1周后行心肌缺血30 min/再灌注4或6 h，并檢測血漿總膽固醇(TC)和三酰甘油(TG)水平，用伊文氏藍-TTC法檢測心肌梗死范圍、用試劑盒檢測血清肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)活性、用TUNEL法和caspase- 3試劑盒檢測細胞凋亡，用Western blot法檢測Akt、ERK1/2表達及磷酸化等。結果HFD-STZ大鼠MI/R損傷加重，雖SCE處理1周對正常動物MI/R損傷無影響，但降低HFD-STZ大鼠TC、TG水平，可將其心肌梗死面積減小至38.4%±2.7%，顯著低于糖尿病組的46.1%±3.2%(P<0.05)，且血清CK、LDH活性及細胞凋亡減少；還可增加HFD-STZ大鼠心肌Akt及ERK1/2磷酸化。用Akt或ERK1/2抑制劑可阻斷SCE的心肌保護作用。結論SCE可有效減輕糖尿病大鼠MI/R損傷，可能與其降脂并激活Akt及ERK1/2信號有關。

決明子；糖尿病；心肌缺血/再灌注損傷；Akt；ERK1/2

糖尿病是心血管疾病的主要危險因素之一，2型糖尿患者患缺血性心臟病(ischemic heart disease, IHD)的風險是非糖尿病患者的2～4倍，且糖尿病患者發生心肌梗死后的病死率更高[1]。已證實在Zucker肥胖大鼠，缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion, MI/R)所誘導的心肌細胞凋亡明顯高于對照組，提示糖尿病狀態下缺血心肌易損性增加。

近年，中草藥及其活性成分在防治心血管病中的作用受到重視。決明子(semen cassiae，SC)在中醫實踐中用于預防和治療高脂血癥及減肥等[2]。其提取物(semen cassiae extract，SCE)可顯著降低高脂血癥模型的血漿低密度脂蛋白(LDL)及三酰甘油(TG)水平，并升高高密度脂蛋白(HDL)水平[3]。從SC提取的可溶性纖維可降低高質飲食誘導的肥胖模型的血漿及肝臟的脂質水平[4]。臨床研究還顯示他汀類及貝特類降脂藥可降低心血管事件的危險度[5]。然而，同樣有降脂效應的SCE對MI/R心肌損傷、尤其是糖尿病狀態下的心肌損傷的影響尚不清楚。本研究擬觀察SCE對正常和糖尿病大鼠MI/R損傷的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

鏈脲霉素(STZ，Sigma公司)，決明子(SC)由第四軍醫大學藥物研究所鑒定，水煎液凍干粉占初始物的提取率約為3.9%。胰島素放射免疫分析試劑盒、血清三酰甘油(TG)和總膽固醇(TC)試劑盒(北京北方生物技術研究所)。肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成公司)。原位末端轉移酶標記法細胞凋亡試劑盒(TUNEL，Roche公司)，caspase- 3試劑盒(Chemicon公司)。Akt、pAkt、ERK1/2和pERK1/2抗體(Cell Signaling公司)。

1.2 方法

1.2.1 構建2型糖尿病大鼠模型：用高脂飼料-STZ法誘導，空腹血糖≥16.7 mmol/L為2型糖尿病模型構建成功[6]。

1.2.2 實驗分組：大鼠隨機分為對照組(con)、SCE處理組(con+SCE)、糖尿病組(DM)和糖尿病SCE處理組(DM+SCE)，每組例數=8。SCE處理為持續1周每天灌胃(10 mg/kg，懸浮于0.9%氯化鈉注射液)[7]。1周后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg)，常規制備大鼠MI/R模型，心肌缺血30 min后再灌注4 h，檢測心肌損傷及信號分子。為研究SCE的作用機制，用PI3K特異性抑制劑wortmannin(1.4 mg/kg, i.p.)或ERK1/2特異性抑制劑PD98059(5 mg/kg, i.p.)在缺血前15 min預處理，再觀察心肌損傷及信號分子。

1.2.3 細胞凋亡和心肌梗死檢測：分別按照TUNEL和caspase- 3試劑盒說明書檢測心肌TUNEL陽性細胞與caspase- 3活性，用伊文氏藍-TTC法檢測心肌梗死范圍[8]。

1.2.4 血漿TC和TG水平、血清CK和LDH活性檢測：按照試劑盒說明書操作。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 血糖、血胰島素、總膽固醇、三酰甘油水平及體質量

與正常組相比，HFD-STZ大鼠空腹血糖明顯升高(≥16.7 mmol/L)，血漿TC和TG增高，TC：(4.63±0.10)mmol/Lvs(1.57±0.12)mmol/L，與對照組相比(P<0.01)；TG：(1.13±0.08)mmol/Lvs(0.68±0.09)mmol/L，與對照組相比(P<0.05)，體質量下降(220±16)gvs(272±18)g，與對照組相比(P<0.05)，SCE處理1周可顯著降低HFD-STZ大鼠TC和TG水平，分別為(2.10±0.13)mmol/L與(0.85±0.06)mmol/L，與糖尿病組相比(P<0.05)。

2.2 SCE促進糖尿病大鼠MI/R后心臟功能恢復和減輕心肌損傷

與對照組相比，DM大鼠在再灌注末左室壓最大上升與下降速率(±LVdP/dtmax)明顯降低,+LVdP/dtmax：(2 937±85)mmHg/svs(3 329±111)mmHg/s(1 mmHg = 0.133 kPa)；-LVdP/dtmax：(2 453±72)mmHg/svs(2 670±70)mmHg/s；與對照組相比(P<0.01)。而SCE處理1周對正常大鼠的上述指標無明顯影響，但可顯著增高DM大鼠的±LVdP/dtmax,+LVdP/dtmax：(3 207±96)mmHg/s，與糖尿病組相比(P<0.05)；-LVdP/dtmax：(2 733±73_mmHg/s，與糖尿病組相比(P<0.01)。

與對照組相比，MI/R可使DM大鼠出現更大的心肌梗死范圍，更高的CK和LDH活性(表1)，且凋亡指數AI和caspase- 3活性也較高(圖1)。SCE處理1周對正常大鼠的上述指標無明顯影響，但可顯著減少DM大鼠的心肌梗死范圍，降低血漿CK、LDH活性，抑制心肌細胞凋亡和caspase- 3活性。

表1 大鼠心肌梗死范圍、血漿肌酸激酶與乳酸脫氫酶活性

INF.infarct size; AAR.area at risk; CK.creatine kinase; LDH.lactate dehydrogenase;*P<0.05 compared with con;#P<0.05 compared with DM.

A.top: representative photomicrographs of terminal deoxynucleotidyl nick-end labeling (TUNEL) staining in ischemic heart tissue(×400); bottom:percentage of TUNEL-positive nuclei; B:myocardial caspase- 3 activity;*P<0.05 compared with con;#P<0.05 compared with DM

圖1 SCE預處理減少糖尿病大鼠MI/R誘導的心肌細胞凋亡

2.3 SCE減輕糖尿病大鼠MI/R損傷的分子機制

與對照組相比，DM組心肌Akt及ERK1/2磷酸化明顯減少(P<0.05)(n=3)。SCE處理1周對正常大鼠的上述指標無明顯影響，但可顯著增加DM大鼠的Akt及ERK1/2磷酸化(圖2)。用PI3K抑制劑wortmannin或ERK1/2抑制劑PD98059在分別抑制Akt或ERK1/2磷酸化的同時，可阻斷SCE降低DM大鼠心肌caspase- 3活性與血漿CK、LDH活性的作用(圖3)。

3 討論

中藥決明子(SC)有清肝明目作用，也用于降脂、治療頭疼及頭暈等[9]。新近研究者采用高效液相色譜法(HPLC)提取了SC的有效成分，并繪制了指紋圖譜。所提取的13種含量較高的有效成分，其中11種是蒽醌類，包括大黃素甲醚、大黃素、大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素、橙黃決明素等[10]；這些成分也是研究最多的SC有效成分，被廣泛報道。其他的成分還有萘并吡喃酮類、脂肪酸、氯基酸類等。通過對提取劑乙醇濃度、固液比、浸提時間、浸提溫度、浸提次數進行單因素梯度實驗，觀察了多種提取方法對SC中蒽醌、多糖和黃酮提取率的影響，實驗表明SC的總的提取率較低，最大提取率為0.35%，用乙醇提取SC中有效成分蒽—醌遠低于水提取物，提示單就蒽醌一種有效成分最好采用水提取的方法。因此，水提法被廣泛用來提取SC有效成分并研究其藥效。水提法提取的SCE有神經保護作用，可減少小鼠腦缺血引起的記憶障礙和神經損害[7]，且SCE可減輕鈣轉運障礙和減少神經細胞死亡[11]。SCE對MI/R心肌損傷、尤其對糖尿病時的心肌損傷的影響尚無報道。本研究發現SCE可減少糖尿病大鼠MI/R誘導的心肌損傷和促進心功能恢復。細胞凋亡在MI/R誘導的心肌損傷中發揮重要作用，心肌缺血可促發細胞凋亡，而再灌注可使凋亡大幅增加[11]。Zucker糖尿病大鼠MI/R誘導的心肌細胞凋亡顯著增加，提示糖尿病可加重心肌損傷[12]。SCE可降低6-羥多巴胺處理的PC12細胞的caspase- 3活性[13]。本研究證實SCE處理1周可減少糖尿病而非正常大鼠MI/R誘導的心肌細胞凋亡指數，并降低caspase- 3活性，還可降低糖尿病大鼠TC及TG水平，提示SCE對糖尿病缺血心肌的保護作用可能是基于其抗凋亡效應及降脂作用。

PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信號是重要的促細胞生存的通路，增加Akt和ERK1/2磷酸化可介導細胞增殖、促生存并減輕MI/R損傷[14]。與文獻報道一致，筆者也觀察到Akt和ERK1/2磷酸化在糖尿病狀態減弱[15]。

A.representative blots of total and phosphorylation of Akt in heart tissue from rats subjected to MI/R; B.ERK1/2;*P<0.05 compared with con;#P<0.05 compared with DM

圖2 SCE預處理增加糖尿病大鼠缺血心肌的Akt和ERK1/2磷酸化

Fig 2 Total and phosphorylated of Akt and ERK1/2 levels and the modification by SCE treatment (n=3)

A.representative blots of total and phosphorylation of Akt in heart tissue from rats subjected to MI/R; B.ERK1/2; C.myocardial caspase- activity; D.Plasma CK and LDH activities;*P<0.05 compared with MI/R;#P<0.05,##P<0.01 compared with SCE

圖3 SCE預處理通過激活Akt和ERK1/2保護糖尿病大鼠缺血/再灌注心肌

Fig 3 SCE attenuated MI/R injury in diabetic animals via activation of Akt and ERK1/2 (n=3)

SCE可顯著恢復糖尿病心肌的Akt和ERK1/2磷酸化，且PI3K抑制劑wortmannin或ERK1/2抑制劑PD98059在抑制Akt或ERK1/2磷酸化的同時，可阻斷SCE降低細胞凋亡與血漿CK及LDH活性。提示，SCE可通過激活PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信號通路保護糖尿病缺血心肌。Akt和ERK1/2可通過調節抗凋亡和促凋亡蛋白和轉錄因子來促細胞生存，促凋亡分子Bcl- 2家族成員BAD可在Akt的Ser136和ERK1/2的Ser112位點磷酸化后被調節失活。

總之，SCE可顯著促進糖尿病大鼠MI/R心功能恢復、減輕心肌損傷和凋亡，其機制可能與其降脂效應及激活Akt和ERK1/2通路有關。決明子可能作為降低糖尿病患者缺血心肌易損性、改善預后的候選藥。

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新聞點擊

只有5%如廁者正確地洗手

據英國《BBC新聞》(BBC NEWS)2013-06-18報道，近期發表于《環境衛生雜志》(Journal of Environmental Health)的一篇美國研究報告指出，95%的民眾如廁后洗手的時間都過短，以致于無法有效殺死害菌。研究人員對于人們正確洗手的比例偏低感到驚訝。

在這項研究中，密西根大學研究團隊訓練了12位學生在酒吧、餐廳及其它公共場合里觀察并搜集人們在如廁后的洗手行為。經研究3 749個樣本后發現，就平均而言，人們上完廁所后洗手的時間僅6s，只有5%的人洗手超過15s以上。

美國疾病控制與預防中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)建議說，人們最少應該使用肥皂和清水洗手15～20 s(或者哼唱“生日快樂歌”2遍的時間)，而且還應該清洗手指之間以及手掌部位。

該中心指出，洗手是減少疾病傳染的一個有效方法。臟手會污染食物，可能讓食物中毒發生的幾率增加大約50%。密西根大學的研究顯示，僅有2/3的人使用肥皂洗手，而1/10的人根本不洗手，這種情形男性比女性更嚴重。

若區分男性與女性，只有50%的男性使用肥皂洗手，有15%的男性根本不洗手；而女性則有78%用肥皂洗手，7%不洗手。

研究人員還發現，如果洗手臺很骯臟，人們就不太愛洗手；反之，人們則會拉長洗手的時間。

Semen cassiae extract attenuates myocardial ischemia and reperfusion injury in type 2 diabetic rats

LIU Li-bing1*, ZHANG Hai-feng2*

(1.College of Nursing, Xijing University, Xi’an 710123; 2.Experiment Teaching Center, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China)

Objective Obese patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM) characterized by hyperglycemia are liable to more severe myocardial infarction. Semen Cassiae is proved to reduce serum lipid level. This study was to investigate whether the Semen Cassiae extract (SCE) reduces myocardial ischemia and reperfusion (MI/R) injury with or without diabetes and the underlying mechanisms. Methods The high-fat diet-fed streptozotocin (HFD-STZ) rat model was used as T2DM model. Normal and DM rats

SCE treatment orally(10 mg/kg/day) for 1 week. Subsequently these animals were subjected to MI/R. Results Compared with the normal animals, DM rats showed increased plasma total cholesterol (TC) and triacylglycerol (TG), more severe MI/R injury and cardiac functional impairment. SCE treatment significantly reduced the plasma TC and TG, improved the instantaneous first derivation of left ventricle pressure and reduced infarct size, decreased plasma creatine kinase and lactate dehydrogenase levels, and reduced apoptosis index at the end of reperfusion in diabetic rats. Moreover, SCE treat- ment increased the antiapoptotic protein Akt and stimulated ERK1/2 phosphorylation. Pretreatment with a PI3K inhibitor wortmannin or an ERK1/2 inhibitor PD98059 not only blocked Akt and ERK1/2 phosphorylation, but also inhibited the cardioprotective effects of SCE. However, SCE treatment did not show any effects on the MI/R injury in the normal rats.Conclusions SCE effectively improves myocardial function and reduces MI/R-induced injury in diabetic but not normal animals, which is potentially attributable to the reduced TC/TG levels and the triggered cell survival signaling Akt and ERK1/2.

semen cassiae; diabetes; myocardial ischemia/reperfusion injury; Akt; ERK1/2

2014- 05- 06

2014- 07- 18

國家自然科學基金 (81270330)；陜西省科學技術研究發展計劃(2013KJXX-89)

1001-6325(2015)01-0001-06

R331.3

A

*通信作者(corresponding author)：liulibing@163.com; hfzhang@fmmu.edu.cn