不同+Gz重復持續暴露對大鼠肝臟組織損傷及GRP78的表達影響

胡 深，張洪義*，趙 剛，劉 壘，史 斌，李文兵，常 鵬

(1.安徽醫科大學 空軍臨床學院， 安徽 合肥 230023； 2.中國人民解放軍空軍總醫院 肝膽外科， 北京 100142；3.大連醫科大學 研究生學院， 遼寧 大連 116044)

?

研究論文

不同+Gz重復持續暴露對大鼠肝臟組織損傷及GRP78的表達影響

胡 深1，張洪義1*，趙 剛2，劉 壘3，史 斌2，李文兵2，常 鵬1

(1.安徽醫科大學 空軍臨床學院， 安徽 合肥 230023； 2.中國人民解放軍空軍總醫院 肝膽外科， 北京 100142；3.大連醫科大學 研究生學院， 遼寧 大連 116044)

目的探討不同正加速度(+Gz)暴露下大鼠肝臟損傷及葡萄糖調節蛋白78(GRP78/Bip)在肝臟組織內分布和表達的變化。方法將SD大鼠24只，隨機分為對照、+6Gz、+9Gz和+12Gz組，每組6只，峰值作用時間3 min，加速度增長率0.5 G/s，間隔30 min，重復間斷連續5次。HE染色觀察肝組織，并測定血漿天冬氨酸轉氨酶(AST) 和丙氨酸轉氨酶(ALT)，用免疫組化法和Western blot測定肝臟組織中GRP78的表達。結果與對照組相比，+9Gz組、+12Gz組轉氨酶水平均顯著升高；且在ALT水平上，+12Gz組高于+9Gz組(P<0.05)；HE染色顯示正加速度組肝細胞排列紊亂，形態不規則，細胞間隙不清晰，空泡樣改變，且隨G值增長而加重。與對照組相比，GRP78/Bip表達分布主要集中在細胞胞質內；各實驗組的GRP78表達均顯著升高(P<0.05)。且+12Gz組明顯高于+6Gz組和對照組(P<0.05)，肝臟組織中GRP78/Bip蛋白表達水平隨G值升高而升高；+12Gz組和+9Gz組都高于+6Gz組和對照組(P<0.05)。結論GRP78/Bip的表達可能在加速度引起的肝臟應激反應有著正相關的作用。

加速度；肝損傷；葡萄糖調節蛋白78；病理；免疫組化；蛋白質印跡

進入21世紀以來，隨著高性能戰機的裝備使用，高+Gz的過載值、重視短距起降、發展超音速遠程巡航作戰能力和“隱身”能力成為各國空軍的發展目標，也導致空勤人員所處的航空生理環境發生相應的變化。飛行員經常、反復地暴露于+Gz 環境中，身體各系統會產生應激反應。目前國內外關于+Gz對腦、心、腎等重要器官影響的研究報道很多,現已證實重復持續加速度對于大鼠模型心臟和大腦的病理生理改變有影響[1- 2]，但關于+Gz對肝臟影響的研究較少。葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78)又稱為Bip，其定位于內質網，是內質網穩態的中心調節劑[3]。GPR78/Bip蛋白通過在內質網中協助多聚體蛋白質復合物的形成，起到保護和維持細胞正常代謝作用。最近10年內，有關GRP78/Bip的研究以氧化應激、內質網應激、創傷應激以及藥物和營養物質缺乏應激居多。本研究通過離心機實驗模擬重復持續性+Gz對大鼠肝臟影響，觀察不同高+Gz下肝臟細胞的損傷變化，探討其損傷的原理及不同+Gz條件下肝組織中GRP78/Bip 含量變化及其意義。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級雄性Wistar大鼠24只，體質量(195±10)g(由軍事醫學科學院動物中心提供，編號:SCKK- 2012-COO4)；GRP78、牛血清蛋白BSA(Sigma公司)；DAB顯色(ZSGB-BIO公司)；光學顯微鏡(Olimpus BX51)；圖像分析系統(CMIAS，空軍總醫院)；蛋白提取混合劑(凱基公司)；BCA蛋白測定試劑盒(索萊寶公司)；TEMED、 Tris堿、甘氨酸GLYCINE(AMRESCO公司)；預染的蛋白Marker (Trermo公司)；β-actin 單克隆抗體、羊抗兔二抗(中杉公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組：大鼠適應飼養1周后進行實驗。隨機分成對照組、+6Gz組、+9Gz組和+12Gz組，每組6只。

1.2.2 造模與取材：參照文獻[4]等的加速度暴露方法建立模型；實驗結束后30 min，使用10%水合氯醛麻醉(0.5 mL/100 g)，無菌操作，經腹正中線剖腹，下腔靜脈采血，然后迅速切取肝臟標本，每只動物肝臟切割保存5塊大小約為1 cm×1 cm×1 cm，切割部位隨機選取，使用0.9%氯化鈉注射液沖洗肝組織上殘留血液，用10%甲醛固定；其余部分迅速液氮冷凍保存。

1.2.3 血清轉氨酶ALT和AST:ALT和AST檢測麻醉后常規肝下下腔靜脈采血4 mL，用全自動生化分析儀檢測血清AST、ALT水平。

1.2.4 HE染色和光鏡觀察：取新鮮肝臟組織塊，常規修整制作HE切片。光學顯微鏡下進行觀察組織形態學變化。

1.2.5 大鼠肝組織GRP78蛋白免疫組化：常規石蠟包埋，隨機肝臟組織切片制作，每塊標本隨機連續切片5張，切片厚度5 μm，用ABC法進行免疫組化，主要過程包括：H2O2甲醛封閉內源性過氧化物酶，正常綿羊血清阻斷，胰蛋白酶消化，用PBS漂洗5 min×3次。滴加按要求稀釋的一抗GRP78 (稀釋濃度1∶100)，4 ℃冰箱孵育過夜后，經0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，加生物素化二抗和ABC復合物孵育。DAB顯色。37 ℃孵育30 min DAB 顯色常規脫水透明中性樹膠封片。陽性細胞為黃色, 在光學顯微鏡下觀察整張切片的表達情況，在400倍視野下每張切片隨機選取5個陽性染色區域，光鏡下計數陽性細胞; 并用圖像分析系統測量陽性細胞的平均吸光度、積分吸光度和平均灰度,每個標本取5個視野的平均值做定量分析比較。陽性細胞越多，各值越大，提示免疫反應越強。

1.2.6 Western blot檢測大鼠肝組織GRP78蛋白：秤取肝臟組織塊100 mg，液氮充分研磨，移入玻璃勻漿器，加入蛋白提取混合劑1.5 mL，充分勻漿后冰浴下超聲處理。4 ℃，13 000 r/min離心10 min，取上清。用BCA蛋白測定試劑盒，以牛血清清蛋白作為標準品進行蛋白定量，檢測各樣品蛋白濃度。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔加蛋白提取液20 g，第一孔加入預染的Marker 5 μL，以顯示蛋白位置。電泳條件為恒壓70 mV，30 min，恒壓100 mV，至溴酚藍到膠邊緣。根據marker切膠轉膜，PVDF膜用冷的100%甲醇浸泡10 s，轉膜條件為恒壓80 mV，60 min。轉膜后用洗膜緩沖液清洗5 s，非磷酸化蛋白以5%脫脂奶粉TBST溶液，磷酸化蛋白以5% BSA的TBST溶液室溫封閉1 h。加入1∶1 000 一抗，4 ℃過夜，內參采用小鼠來源抗大鼠β-actin單克隆抗體。TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入1∶10 000稀釋的羊抗兔二抗，內參的二抗為山羊抗小鼠，室溫作用1 h。TBST洗膜3 次，每次5 min。在PVDF膜上滴加化學發光試劑，于暗室中作用1 min后曝光X線片3 min后記錄顯像情況，采用Quantity One v4.6.2軟件進行吸光度(A)值分析，目的蛋白的表達量以目的蛋白條帶與對應β-actin條帶的吸光度值的比值表示。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 血清轉氨酶ALT和AST

與對照組相比，+9Gz組、+12Gz組轉氨酶水平均顯著升高，且在ALT水平上，+12Gz組高于+9Gz組(P<0.05)(表1)。

表1 實驗各組的大鼠血清轉氨酶AST和ALT數據

groupALT(U/L)AST(U/L)control 4238±929 124±42+6Gz 4850±593 134±21+9Gz 5420±475? 166±32+12Gz 6120±896?# 213±80?

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with +6Gz group.

2.2 HE染色和光鏡觀察

肝組織HE染色后光鏡下觀察顯示，對照組大鼠肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，細胞壁完整，形態未見異常；HE染色顯示實驗組肝細胞排列紊亂，形態不規則，細胞間隙不清晰，空泡樣改變，且隨G值增長而加重。+6Gz組部分肝細胞索排列紊亂，輕度水腫，部分細胞壁破壞，形態不規則；+9Gz和+12Gz組部分肝細胞排列紊亂，細胞壁破壞，形態不規則，細胞間的間隙不清晰，部分出現空泡樣改變，明顯水腫，肝竇閉合。肝臟組織病理改變程度隨著Gz增加而加重(圖1)。

2.3 免疫組化結果分析

正常大鼠肝臟組織中也存在GRP78蛋白陽性信號，免疫組化染色陽性信號為棕黃色(箭頭指示)，陽性表達的GRP78 蛋白主要定位于細胞質中，細胞系反應為陰性；實驗組陽性表達更為明顯，棕黃色信號也較為突出。同時，觀察到+9Gz和+12Gz組肝細胞排列紊亂，形態不規則，細胞間隙增寬，空泡樣改變，但以+12Gz組更為嚴重(圖2)。CMIAS 病理分析系統定量分析結果，實驗各組的MA值均比對照組高，且隨G值得升高MA值升高。+9Gz組高于對照組 (P<0.05)，+12Gz組高于+9Gz組(P<0.05)(表2)。

A.stress control group；B.+6Gz group；C.+9Gz group；D.+12Gz group

A.stress control group；B.+6Gz group；C.+9Gz group；D.+12Gz group； Arrow shows the protein expression, Magnification

groupAA IAMGVcontrol 024±001995±0178677±246+6Gz 027±001 1125±0619150±115+9Gz 030±002? 1296±069?9427±211?+12Gz 033±004?# 1456±130?# 10117±341?#

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with +6Gz group.

2.4 Western blot結果分析

在曝光3 min后，+9Gz組和+12Gz組相比差異顯著，蛋白表達水平明顯增加(P<0.05)；同時，+12Gz組較+6Gz組差異也有統計學意義(P<0.05)。各組大鼠肝臟組織GPR78，3 min表達水平(圖3,4)。

圖3 蛋白質印跡法檢測曝光3 min各組大鼠肝臟GPR78蛋白的水平Fig 3 Protein expression of GPR78/Bip in liver of rats under different levels +Gz stress by Western blot after 3 min

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with +6Gz group圖4 GRP78蛋白表達的比較Fig 4 The comparison of GRP78 protein expression

3 討論

現代高性能戰斗機在飛行中產生的+Gz可高達+9Gz以上，其持續時間可達15～45 S，已超出了人體正常的耐受限度。研究發現由于正加速度暴露導致血液向下端肢體和胃腸道分布、回心血量減少，因此有學者推測+Gz暴露可以導致肝動脈和門靜脈向肝臟和膽道系統供血明顯減少，通過誘導肝臟內微循環損害導致肝膽系統繼發性損傷[5]。在正加速度重復暴露下，大鼠肝臟超氧化物歧化酶SOD含量明顯降低，重復+10Gz應激導致肝臟氧自由基代謝能力下降[6]。在持續性加速度暴露作用下，肝臟糖異生作用增加，從而適應不同的G值作用[7]。

本實驗，在不同的重復持續性正加速度(+Gz)的作用下，尤其首次使用12Gz超高值暴露，發現血漿ALT和AST隨G值的增加呈明顯的上升趨勢；HE染色發現細胞索結構紊亂，細胞水腫，肝竇閉合，部分出現空泡樣改變，且以+12Gz組最為嚴重。以往對GRP78的研究發現該蛋白對細胞內外環境的改變極為敏感。在氧化應激、缺血損傷、鈣穩態紊亂時ER應激反應標志就是相關蛋白的表達，主要包括 ER 分子伴侶如 GRP78、GRP94 等[8]。

GRP78/Bip是一種葡萄糖調節性蛋白質,業已證實GRP78/Bip由HSPA5基因編碼，被視為一個重要的管家基因[9]。GRP78/Bip有利于新合成蛋白質的運輸、折疊[10]，其伴侶功能包括細胞間蛋白的傳導、降解不穩定和錯誤折疊的蛋白等。同時，在應激反應調節時其基因的轉錄活性可提高10～25倍，維持ER鈣穩態及內環境的穩定[11]。本研究發現，在加速度作用因素下，機體內可能存在血液從新分配、動物內臟的相互擠壓和離心G值的綜合因素，造成血液的分配不均、離心應激損傷，影響GRP78的表達。

通過本研究，初步證實GRP78受重復持續性+Gz的影響。在持續+Gz條件下肝臟細胞GPR78蛋白表達增強，且隨G值的增加而表達增強。+Gz對肝臟的損傷是一個復雜的病理生理過程。目前從蛋白水平對重復持續性+Gz對肝的應激性損傷的研究仍較少。因而，關于+Gz對肝臟細胞損傷的作用機制，尤其以超高G誘導下，加速度應激和氧化應激之間的具體相關性仍待進一步研究。

[1] Guillaume AI, Osmont D, Gaffié D,etal. Physiological implications of mechanical effects of+ Gz accelerations on brain structures[J]. Aviation, space, and environmental medicine, 2002, 73: 171- 177.

[2] Zawadzka-Bartczak EK, Kopka LH. Centrifuge braking effects on cardiac arrhythmias occurring at high+ Gz acceleration[J]. Aviation, space, and environmental medicine, 2004, 75: 458- 460.

[3] Luo S, Mao C, Lee B,etal. GRP78/BiP is required for cell proliferation and protecting the inner cell mass from apoptosis during early mouse embryonic development[J]. Molecular and cellular biology, 2006, 26: 5688- 5697.

[4] 李文兵, 孔亞林, 何曉軍, 等. 重復持續性+Gz暴露對大鼠肝組織的損傷及機制研究[J]. 解放軍醫學雜志,2014,39: 240- 244.

[5] WU ZA. Gastropic examination and clinical analysis of gastrointestinal ulcers in parachute troop [J]. Chin J Aerospace Med, 2005, 16:58- 59.

[6] Zhang QJ, Zhan H, Li T,etal. Effects of repeated+ Gz exposures on lipid peroxidation of various organs in rats[J]. Aviation, space, and environmental medicine, 2001, 14: 240- 243.

[7] Daligcon BC, Oyama J, Hannak K. Increased gluconeogenesis in rats exposed to hyper-G stress[J]. Life sciences, 1985, 37: 235- 241.

[8] Kaufman RJ. Stress signaling from the lumen of the endoplasmic reticulum: coordination of g ene transcriptional and translational controls [J]. Genes Dev, 1999, 13: 1211- 1233.

[9] Meimaridou E，Gooljar SB，Chapple JP.From hatching to dispatching：the multiple cellular roles of the Hsp70 molecular chaperone machinery [J].J Mol Endocfinol，2009,42:1- 9.

[10] Gething, M.J. Role and regulation of the ER chaperone BiP[J]. Semin Cell Dev Biol, 1999, 10: 465- 472.

[11] Yang G H, Li S, Pestka JJ. Down-regulation of the endoplasmic reticulum chaperone GRP78/Bip by vomitoxin (Deoxynivalenol)[ J]. Toxicol Appl Pharm acol, 2000, 162: 207- 217.

The damage of liver cells and the expression of GRP78 in rats liver tissue after repeated and sustained exposure to different +Gz

HU Shen1, ZHANG Hong-yi1*, ZHAO Gang2, LIU Lei3, SHI Bin2, LI Wen-bing2, CHANG Peng1

(1.Clinical Air Force School of Anhui Medical University, Hefei 230023；2.Dept. of Hepatobiliary Surgery, Air Force General Hospital, PLA,Beijing 100142; 3.Graduate School of Dalian Medical University, Dalian 116044, China)

Objective To observe the damage of liver cells and to investigate the distribution and expression of glucose-regulated protein 78 (Glucose regulated protein78, GRP78/Bip) in liver tissue under the positive acceleration (+ Gz) exposure.Methods Totally 24 wistar rats were randomly assigned to four groups: blank control,+6Gz,+9Gz and +12Gz. Each rat was clamped to the centrifuge arm, prone position, with the head of the rat facing the axis of the centrifuge for +Gz orientation. The onset rate was +0.5 Gz/s, which was used trapezoidal acceleration curve effect and controlled by computer. Blank control group rats were placed on the arm of centrifuge and underwent a process similar to that described above, but they were not exposed to acceleration. +6Gz group,+9Gz group and +12Gz group were subjected at peak time 3 min in animal centrifuge, acceleration rate 0.5 G/s, five times with

interval 30 min between times. In addition, liver tissue of rats were respectively observed by H.E. staining. Mean while, plasma aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) were tested determine the damage of liver function. Results +Gz acceleration stress injury increased serum AST and ALT level. Compared with the stress control, +9Gz group and +12Gz group significantly increased in plasma ALT and AST as compared with control group(P<0.05). +12Gz stress induced the highest level in these groups. The level of ALT in+2Gz group was higher than that in +6Gz group(P<0.05). HE staining showed derangement of liver cells, irregular shape, the cell gap is not clear, vacuolar changes in +Gz groups, and with the increase of G value. Compared with the control group, the expression of GRP78/Bip was focused in the cytoplasm; the expression of GRP78 in the experimental group is higher than that in the control group (P<0.05). +12Gz group was significantly higher than +6Gz group and the control group (P<0.05). The expression of GRP78/Bip in liver tissue increased with the increasing of G value levels; the expression level of GRP78/Bip in +12Gz and +9Gz groups were higher than that in +6Gz and control group (P<0.05). Conclusions There is positively related expression of GRP78/Bip, which was associated with exposure of increasing G values.

acceleration; liver injury; GRP78/Bip;pathology;immunohistochemistry; Western blot

2014- 05- 20

2014- 07- 18

全軍醫學科技“十二五”項目(CKJ12J022)；科技部國家科技支撐計劃(2012BAⅡ15B08)

1001-6325(2015)01-0017-05

文獻標志碼：A

*通信作者(corresponding author)：zhhyjyi1487@163.com