普羅地芬加重大鼠胸主動(dòng)脈球囊成形術(shù)后動(dòng)脈狹窄

王 晶，丁 寧，王 宇

(首都醫(yī)科大學(xué) 附屬北京同仁醫(yī)院 急診科， 北京 100730)

?

研究論文

普羅地芬加重大鼠胸主動(dòng)脈球囊成形術(shù)后動(dòng)脈狹窄

王 晶，丁 寧，王 宇*

(首都醫(yī)科大學(xué) 附屬北京同仁醫(yī)院 急診科， 北京 100730)

目的觀察普羅地芬(Skf525A)對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈球囊成形術(shù)后動(dòng)脈狹窄程度的影響，探討內(nèi)源性細(xì)胞色素P450表氧化酶2J3(Cytochrome P450 epoxygenases，CYP2J3)/環(huán)氧-二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids, EET)系統(tǒng)與血管損傷后動(dòng)脈狹窄的關(guān)系。方法Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(sham組)，胸主動(dòng)脈球囊損傷組(I組)，用普羅地芬干預(yù)上述兩組分別為： sham+Skf及I+ Skf組。 HE染色觀察胸主動(dòng)脈相對(duì)管腔面積(RLA)及內(nèi)膜增生指數(shù)(IPI)，用RT-PCR法檢測(cè)胸主動(dòng)脈CYP2J3 mRNA表達(dá)，用高效液相色譜分析法測(cè)定胸主動(dòng)脈11,12-環(huán)氧-二十碳三烯酸(11,12-EET)含量。結(jié)果與sham組相比， I組RLA明顯縮小，IPI明顯增高(P<0.01)，CYP2J3 mRNA的表達(dá)和11,12-EET含量均明顯升高(P<0.01)；Skf525A處理后明顯縮小I組RLA及明顯增加胸主動(dòng)脈IPI，而明顯降低CYP2J3 mRNA的表達(dá)和11，12-EET含量(P<0.01).結(jié)論CYP2J3/ EETs系統(tǒng)具有拮抗血管損傷后狹窄的作用。

Skf525A；CYP2J3；11,12-EET

冠狀動(dòng)脈支架置入是治療血管阻塞性疾病，實(shí)現(xiàn)血流重建的有效措施。然而,介入術(shù)后血管再狹窄(restenosis, RS)一直是困擾臨床治療遠(yuǎn)期療效的一大難題。再狹窄發(fā)病機(jī)理目前尚未闡明，臨床上亦缺乏防治再狹窄的有效措施[1- 2]。細(xì)胞色素P450表氧化酶2J3(cytochrome P450 epoxygenases，CYP2J3)/環(huán)氧-二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids, EET)系統(tǒng)由于其對(duì)血管的多環(huán)節(jié)作用，近年引起重視[3- 4]。本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，外源性給與缺氧狀態(tài)下血管平滑肌細(xì)胞11,12-EET可以抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖，提示CYP2J3/11,12-EET系統(tǒng)可能參與了術(shù)后再狹窄的發(fā)生。本研究使用細(xì)胞色素P450抑制劑普羅地芬(proadifen，Skf525A)下調(diào)內(nèi)源性CYP2J3/EETs系統(tǒng)，觀察其對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈球囊成形術(shù)后動(dòng)脈狹窄程度的影響，探討內(nèi)源性CYP2J3/EETs系統(tǒng)與血管損傷后動(dòng)脈狹窄的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

清潔級(jí)雄性Wistar大鼠24只，體質(zhì)量280～350 g，[軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK-(軍)，NO：0059020]。

1.2 大鼠胸主動(dòng)脈球囊損傷模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

將大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：假手術(shù)組(sham組)，損傷組(I組)，CYP450抑制劑假手術(shù)組(sham+Skf組)及CYP450抑制劑損傷組(I+Skf組)，每組均6只。假手術(shù)組胸主動(dòng)脈假手術(shù)處理；損傷組行胸主動(dòng)脈球囊損傷術(shù)處理；CYP450抑制劑假手術(shù)組每天腹腔注射0.54 mmol/L Skf525A 10 mL/kg體質(zhì)量，連續(xù)7 d，之后行假手術(shù)；CYP450抑制劑損傷組每天腹腔注射Skf525A，之后行胸主動(dòng)脈球囊損傷術(shù)。

1.3 大鼠胸主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)觀察

采用Image J軟件血管計(jì)算管腔面積(lumenaera area, LA)，每張切片測(cè)3次，取平均值。以增生內(nèi)膜與增生內(nèi)膜和中膜面積之比定義為內(nèi)膜增生指數(shù)(intiimal proliferation index, IPI)；以管腔面積與內(nèi)膜、中膜和管腔面積之和的比為相對(duì)管腔面積(relative luminal area, RLA)。

1.4 大鼠胸主動(dòng)脈11,12-EET 含量測(cè)定

采用高效液相色譜分析系統(tǒng)檢測(cè)胸主動(dòng)脈11,12-EET含量[9]。標(biāo)準(zhǔn)品11,12-EET，流動(dòng)相：A相0. 5%甲酸水溶液，B相0. 5%甲酸乙腈溶液，流速1 mL/min，層析條件：前40 min B相濃度由50%增至65%，其后80 min B相濃度由65%增至100%，最后以B相100%維持20 min。11,12-EET色譜峰出現(xiàn)在第85 min左右。

1.5 大鼠胸主動(dòng)脈CYP2J3 mRNA表達(dá)測(cè)定

用RT-PCR法檢測(cè)組織CYP2J3 mRNA表達(dá)，采用Promega 公司提供的總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒, PCR引物由上海生工生物有限公司合成，北京全式金生物技術(shù)有限公司提供的DNA Marker。

按照試劑說明書進(jìn)行大鼠胸主動(dòng)總RNA提取，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)獲得PCR產(chǎn)物。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠胸主動(dòng)脈相對(duì)管腔面積的變化

I組胸主動(dòng)脈相對(duì)管腔面積較sham組明顯減小(P<0.01)，I+Skf組較I組進(jìn)一步減小 (P<0.01) (圖1)。

*P<0.01 compared with sham group,#P<0.01 compared with I group圖1 胸主動(dòng)脈相對(duì)管腔面積Fig 1 The statistic result of relative luminal area

2.2 各組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜增生指數(shù)的變化

I組胸主動(dòng)脈內(nèi)膜增生指數(shù)較sham組明顯增高(P<0.01)， I+Skf組胸主動(dòng)脈內(nèi)膜增生指數(shù)較I組明顯增高(P<0.01)，sham+Skf組胸主動(dòng)脈內(nèi)膜增生指數(shù)較sham組增高(P<0.05) (圖2，3)。

A.sham; B.sham+Skf; C.I; D.I+Skf圖2 主動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜增生情況Fig 2 The condition of intiimal proliferation following artery injury(×40)

*P<0.05, **P<0.01 compared with sham group; #P<0.01 compared with I group圖3 主動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜增生指數(shù)Fig 3 The statistic result of intiimal proliferation index

2.3 各組大鼠胸主動(dòng)脈CYP2J3 mRNA表達(dá)的變化

I組胸主動(dòng)脈CYP2J3 mRNA表達(dá)較sham組明顯增高(P<0.01)，I+Skf組胸主動(dòng)脈CYP2J3 mRNA表達(dá)較I組明顯降低(P<0.01)，sham+Skf組胸主動(dòng)脈CYP2J3 mRNA的表達(dá)比sham組明顯降低(P<0.01) (圖4)。

A.the expression of CYP2J3 mRNA; 1=sham，2=I，3=sham+Skf，4=I+Skf，5=marker; B.the statistic result of CYP2J3 mRNA expression;*P<0.01 compared with sham group; #P<0.01 compared with I group圖4 囊損傷后主動(dòng)脈CYP2J3 mRNA表達(dá)的變化Fig 4 Expression of CYP2J3 mRNA in artery tissues

2.4 各組大鼠胸主動(dòng)脈11,12-EET含量的變化

I組胸主動(dòng)脈11,12-EET含量比sham組明顯增高(P<0.01)，I+Skf組胸主動(dòng)脈11,12-EET含量較I組明顯降低(P<0.01)，sham+Skf組胸主動(dòng)脈11,12-EET含量比sham組明顯降低(P<0.01) (圖5)。

* P<0.01 compared with sham group; #P<0.01 compared with I group圖5 球囊損傷后主動(dòng)脈11,12-EET含量的變化Fig 5 The statistic result of content of 11,12-EET

3 討論

CYP2J3/ EET系統(tǒng)具有促進(jìn)氧自由基清除，拮抗細(xì)胞損傷[5]、舒張血管、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[6]、抗血栓形成[7]、拮抗血管平滑肌細(xì)胞的增生及遷移[8- 9]等作用，提示內(nèi)源性CYP/EETs系統(tǒng)對(duì)血管損傷后狹窄可能具有多環(huán)節(jié)的拮抗作用。但是血管成形術(shù)后內(nèi)源性CYP2J3/EETs系統(tǒng)如何改變尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠胸主動(dòng)脈球囊損傷術(shù)后15 d，I組胸主動(dòng)脈CYP2J3 mRNA表達(dá)及11,12-EET含量均較sham組升高，提示血管損傷可以使內(nèi)源性CYP2J3/ EETs系統(tǒng)發(fā)生上調(diào)。而I組胸主動(dòng)脈相對(duì)管腔面積小于sham組且胸主動(dòng)脈內(nèi)膜增生指數(shù)大于sham組，進(jìn)一步證實(shí)動(dòng)脈損傷狹窄時(shí)內(nèi)源性CYP2J3/EETs系統(tǒng)上調(diào)。

然而血管損傷造成的內(nèi)源性CYP2J3/EETs系統(tǒng)上調(diào)是拮抗還是促進(jìn)血管狹窄也不清楚。為此，本研究給予動(dòng)物CYP450抑制劑Skf525A，觀察抑制內(nèi)源性CYP2J3/EETs系統(tǒng)后血管的改變，了解內(nèi)源性CYP2J3/EETs系統(tǒng)上調(diào)究竟起何作用。本研究發(fā)現(xiàn)，sham+Skf組與sham組相比胸主動(dòng)脈CYP2J3 mRNA表達(dá)及11,12-EET含量均降低，表明Skf525A可有效地抑制大鼠內(nèi)源性CYP2J3/EETs系統(tǒng)。I+Skf組與I組相比胸主動(dòng)脈CYP2J3 mRNA表達(dá)及11,12-EET含量均降低，同時(shí)I+Skf組胸主動(dòng)相對(duì)管腔面積小于I組，且胸主動(dòng)脈內(nèi)膜增生指數(shù)大于I組，說明抑制內(nèi)源性CYP2J3/ EETs系統(tǒng)加重血管損傷后狹窄的程度。綜上，提示血管損傷造成的內(nèi)源性CYP2J3/EETs系統(tǒng)上調(diào)，可能是發(fā)揮拮抗血管損傷后狹窄的作用。換言之，動(dòng)脈損傷引起的內(nèi)源性CYP2J3/EETs系統(tǒng)上調(diào)，可能是一種代償，是拮抗血管損傷后再狹窄的重要機(jī)制。

[1] 楊娜,趙學(xué)忠,王全偉,等.冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄的研究進(jìn)展[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2014，6：1731- 1733.

[2] 劉培，邵鐵梅，李雪，等.血管緊張素Ⅱ?qū)ρ芡饽こ衫w維細(xì)胞亞群增殖的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013，29:292- 293.

[3] Iliff JJ, Wang R, Zeldin DC,etal. Epoxyeicosanoids as mediators of neurogenic vasodilation in cerebral vessels[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2009,296:1352- 1363.

[4] Zhao X, Dey A, Romanko OP. Decreased epoxygenase and increased epoxide hydrolase expression in the mesenteric artery of obese Zucker rats[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2005;288:R188- 196.

[5] 馬立權(quán), 王紅霞, 油紅捷, 等.缺血后處置緩解離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，27:259- 262.

[6] Potente M, Fisslthaler B, Busse R,etal.11,12-epoxyeicosatrienoic acid-induced inhibition of FOXO factors promotes endothelial proliferation by down-regulating p27Kip1[J]. J Biol Chem，2003,8，278:29619- 29625.

[7] Krotz F, Riexinger T, Buerkle MA,etal.Membrane pPotential-dependent inhibition of platelet adhesion to endothelial cells by epoxyeicosatrienoic acids[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004,24:595- 600.

[8] Sun J, Sui X, Bradbury JA,etal.Inhibition of vascular smooth muscle cell migration by cytochrome p450 epoxygenase-derived eicosanoids[J].Circ Res，2002，90:1020- 1027.

[9] Dubey RK, Gillespie DG, Zacharia LC,etal.CYP450-and COMT-derived estradiol metabolites inhibit activity of human coronary artery SMCs[J].Hypertension, 2003,41: 807- 813.

Prodifen increased thoracic aorta artery stenosis after balloon angioplasty in rat

WANG Jing, DING Ning, WANG Yu*

(Dept. of Emergency, Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing 100730, China)

Objective To observe the effect of Prodifen (Skf525A) on rat thoracic aorta artery stenosis after balloon angioplasty and to discuss the relationship between endogenous Cytochrome P450/epoxyeicosatrienoic acids (CYP2J2/EETs) system and artery stenosis after vascular injury. Methods Totally 24 Wistar rats were randomly divided into four groups assigned to the following treatments: sham group, I group (treated by ballon angioplasty for 15 d). Using sham+Skf group (administrated with Skf525A), I+Skf group (administrated with Skf525A, then treated by ballon angioplasty for 15 d). Relative luminal area (RLA) and the intimal proliferation index (IPI) were observed by HE staining; The expression of Cytochrome P450 epoxygenase 2J3 (CYP2J3) mRNA was determined by semi-quatative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR); the level of 11,12-EET was detected by high pressure liquid chromatography (HPLC). Results Compared with sham group, RLA significantly decreased, IPI significantly increased,CYP2J3 mRNA expression and the content of 11,12-EET all significantly increased in I group (P<0.01). Compared with I group, Skf525A treatment significantly decreased RLA, increased IPI, and decreasedCYP2J3 mRNA expression and the content of 11,12-EET (P<0.01).ConclusionsCYP2J3/EETs system can inhibit stenosis after vascular injury.

Skf525A; CYP2J3; 11,12-EET

2014- 05- 15

2014- 08- 25

北京市自然科學(xué)基金(7062007)

1001-6325(2015)01-0022-04

R543.1

A

*通信作者(corresponding author)：tryywy@163.com