miRNA- 449a在人肺癌及癌旁組織中的差異表達

林劍勇，鄧益斌，羅艷紅，陸小嬋，黃永秩

(右江民族醫學院 附屬醫院 1.呼吸內科; 2.檢驗科; 3.臨床病理科, 廣西 百色 533000)

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研究論文

miRNA- 449a在人肺癌及癌旁組織中的差異表達

林劍勇1，鄧益斌2*，羅艷紅2，陸小嬋3，黃永秩3

(右江民族醫學院 附屬醫院 1.呼吸內科; 2.檢驗科; 3.臨床病理科, 廣西 百色 533000)

目的探討miRNA- 449a在人肺癌及癌旁組織中的表達差異及其臨床意義。方法右江民族醫學院附屬醫院2011- 01- 01—2013- 06- 30收治的肺癌患者58例，對照組為癌旁正常組織，病例組為鱗癌組織和腺癌組織，并根據miRNA- 449a序列結構設計合成miRNA- 449a模擬物，設10和20 mg/mL兩個不同濃度，以0 mg/mL為陰性對照，用real-time PCR檢測肺癌及其對應癌旁組織中miRNA- 449a的表達; 化學發光技術檢測細胞內熒光素酶基因表達; 四甲基偶氮唑藍法檢測細胞活性。結果鱗癌組和腺癌組的miRNA- 449a的表達量為1.48±1.63和1.52±1.54，均顯著低于癌旁正常對照組的2.74±1.55(P<0.01)，且與瘤體大小有關(P<0.05)。10和20 mg/mL 組細胞內的平均熒光強度為2 115±168和1 352±159，均顯著低于陰性對照組的4 975±115(P<0.01)，且抑制作用隨濃度增加呈遞增趨勢。結論miRNA- 449a在肺癌組織中呈低表達，可下調細胞內熒光蛋白表達和誘導細胞凋亡。

肺腫瘤; miRNA- 449a; 腫瘤標志; 聚合酶鏈反應; 熒光定量

肺癌是中國及全球范圍內發病率最高的惡性腫瘤之一[1- 2]。絕大部分患者被發現時已是中晚期，經治療后5年生存率不到20%[3- 5]，主要原因是缺少早期診斷方法。microRNA(miRNA)是近年來新發現的一種內源性、非編碼單鏈小分子RNA，長度約為20～25個核苷酸，主要與靶基因mRNA的非編碼區或編碼區不完全互補結合，促使靶基因mRNA降解或抑制轉錄后蛋白翻譯過程有關，并在細胞的生長、增殖、凋亡和分化方面扮演著重要角色[6- 7]。miRNA 的異常表達與腫瘤的發生發展密切相關，可作為新的腫瘤標志物[8]。miRNA- 449a是5號染色體上miRNA- 449的編碼產物之一，有資料表明其與結直腸癌、肝癌和卵巢癌等癌癥顯著相關[9]，但其在肺癌組織中的表達情況及其意義尚不清楚，因此，本研究擬采用real time PCR檢測肺癌及其對應癌旁組織中miRNA- 449a的表達量，并采用熒光電子顯微鏡技術和MTT實驗檢測其模擬物對人肺癌細胞系95D細胞凋亡的影響，進一步探討其臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集2011- 01- 01—2013- 06- 30右江民族醫學院附屬醫院收治并確診的肺癌患者58例作為研究對象，年齡32～73歲，平均年齡52.5歲，中位年齡56歲。男40例，女18例。鱗癌22例，腺癌36例; 年齡≥50歲42例，年齡<50歲16例; 瘤體≥5 cm 38例，瘤體<5 cm 20例，取肺癌組織及遠端對照正常組織(距癌組織>5 cm)。所有肺癌患者術前均未做放療、化療及其他針對腫瘤的治療。標本留取前已經醫院倫理委員會批準，并由患者簽署知情同意書。全部標本手術后30 min內保存于液氮中。

1.2 細胞培養

人肺癌細胞系95D細胞(ATCC細胞庫)用10%胎牛血清(含氨基酸和葡萄糖)的培養基于37 ℃、5% CO2濕化培養箱中培養。

1.3 主要試劑

Tizol試劑盒和LipofectaminTM2000等(Invitrogen公司); 反轉錄熒光定量PCR試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司); Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物技術有限公司); 引物及miRNA- 449a模擬物的設計與合成(上海生工生物工程股份有限公司);化學發光試劑盒(Bright-GloTM熒光素酶分析系統)(Promega公司)。

1.4 RT-PCR檢測miRNA- 449a

1)RNA提取：從液氮中取組織約500 mg，采用Tizol試劑提取總RNA，利用紫外分光光度計檢測提取RNA濃度和純度，當A260/A280比值為1.8～2.1認為提取的RNA純度合格。并采用1%瓊脂糖凝膠電泳法鑒定RNA的完整性，當28 S/18 S亮度比值>2.0認為提取的RNA完整性良好。

2)miRNA- 449a表達檢測：采用real time PCR技術，以U6為內參。U6反轉錄引物為5′-GTCGT ATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATAC GACAAAATATGGAACTGC-3′，上游引物為5′-GGG TGCTCGCTTCGGCAGC-3′，下游引物為5′-CAGTGC AGGGTCCGAGGT-3′。采用反轉錄引物，把總RNA反轉錄為cDNA，其反應體系為：10×反轉錄緩沖液1.5 μL，100 nmol/L dNTPs 0.15 μL，反轉錄酶1.0 μL，RNase抑制劑0.19 μL，反轉錄引物3.0 μL，總RNA 5.0 μL，加DEPC(焦碳酸二乙酯)水至15 μL，輕輕混勻后，16 ℃，30 min; 42 ℃，60 min; 85 ℃，5 min; 4 ℃，保存。熒光定量PCR檢測反應體系為：2×PCR緩沖液10 μL，20×miRNA- 449a特定引物和熒光探針1 μL，反轉錄產物1 μL，加DEPC水至20 μL，置ABI 7500熒光PCR儀上按照95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s反應40個循環，采集數據分析結果。

1.5 化學發光技術檢測細胞內熒光素酶基因表達

采用化學發光技術檢測，嚴格按照試劑和儀器說明書操作，輸出值以每秒周數(CPS)表示。

1.6 MTT法檢測miRNA- 449a模擬物對細胞的毒性

采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測miRNA- 449a模擬物對細胞活性的影響。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 RNA純度與miRNA- 449a的表達

A260/A280比值為2.06，A260/A230比值為2.21，28 S、18 S條帶清晰，28 S/18 S亮度比值大于2.0(圖1)。鱗癌組和腺癌組的miRNA- 449a表達量分別為1.48±1.63和1.52±1.54，均顯著低于癌旁正常對照組的2.74±1.55(P<0.05)。

圖1 RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 1 RNA agarose gel electrophoresis

2.2 miRNA- 449a表達與臨床病理特征關系

miRNA- 449a表達與瘤體大小有關(P<0.05)，與其他病理特征無關(表1)。

表1 miRNA- 449a表達與臨床病理特征關系

clinicalpathologicalfeaturesnexpressionofmiRNA?449aage(years) <5016188±078 ≥5042183±091gender male40191±093 female18185±082pathologictypes squamouscellcarcinomas22201±088 adenocarcinoma36175±081clinicalstaging Ⅰ～Ⅱ21155±082 Ⅲ～Ⅳ37189±078tumorsize(cm) <520123±073 ≥538062±059?

*P<0.05 compared with tumor size <5 cm.

2.3 miRNA- 449a模擬物對細胞內熒光素酶基因表達的影響

10和20 mg/mL 組細胞內的平均熒光強度為2 115±168和1 352±159，均顯著低于陰性對照組(4 975±115)(P<0.05)，且抑制作用隨濃度增加呈遞增趨勢。

2.4 miRNA- 449a模擬物對細胞活性的影響

轉染48 h后，采用MTT比色法測定各組吸光度值A，結果顯示：10 和20 mg/mL組的A值分別為0.71±0.54和0.45±0.38，均明顯低于陰性對照組的1.35±1.02(P<0.05)。

3 討論

肺癌是一種多基因疾病，其發生、發展是多因素參與、多種相關基因失活共同作用的結果，是高發病率和高死亡率的癌癥之一，也是預后較差的癌癥之一。miRNA是一類長約20～23 nt的可調控基因表達的高度保守非編碼小RNA，在腫瘤發生、發展和轉移中起著促進或抑制的作用。miRNA- 145、miRNA- 34a、miRNA- 212和miRNA- 182等可通過上調凋亡蛋白的表達，誘導腫瘤細胞凋亡，從而阻遏腫瘤細胞的生長[10- 13]。此外，還發現肺癌患者血清中miRNA- 21的表達顯著高于良性肺部疾病患者及健康體檢者[14]。據此推測，miRNA可能作為一種潛在的腫瘤基因診斷與治療研究的靶標[9]。

本研究結果表明，miRNA- 449a在肺癌組織中的表達水平顯著低于癌旁正常組織，且與瘤體大小有關，與年齡、性別、臨床病例類型等無關，提示miRNA- 449a參與了肺癌的發生、發展過程，可能是一個潛在的抑癌因子。陽離子脂質體介導體miRNA- 449a模擬物轉染肺癌細胞系95D細胞，發現miRNA- 449a模擬物能有效下調細胞內熒光蛋白的表達強度，且呈劑量效應。同時，熒光電子顯微鏡下觀察還發現，miRNA- 449a模擬物能夠明顯誘導肺癌細胞的凋亡，且隨劑量增高細胞凋亡數呈上升趨勢，提示miRNA- 449a可能通過下調靶蛋白表達及誘導細胞凋亡來發揮抑制癌細胞增殖的作用。但miRNA- 449a作為肺癌的早期診斷標志，仍有待于進一步利用ROC曲線來評價其診斷肺癌的靈敏度和特異度。鑒于本研究所納入樣本量有限，仍存在偶然誤差的可能，因此，有待進一步在動物實驗中加以驗證。

綜上所述，miRNA- 449a可能通過下調肺癌細胞內靶蛋白的表達及誘導細胞凋亡來發揮抑制癌細胞增殖的作用，其可能成為肺癌早期診斷與治療的靶分子。

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Different expression of miRNA- 449a in lung cancer and precancerous tissue

LIN Jian-yong1, DENG Yi-bin2*, LUO Yan-hong2, LU Xiao-chan3, HUANG Yong-zhi3

(1.Dept. of Respiratory Medicine; 2.Central Laboratory; 3.Dept. of Clinical Pathology, Affiliated Hospital of Youjiang Medical College for Nationalities, Baise 533000, China)

Objective To investigate the expression and biological function of miRNA- 449a in lung cancer. Methods A case-control study was conducted in 58 patients diagnosed with lung cancer(carcinoma and adenocarcinoma) and normal tissue closely adjacent to tumor. MiRNA- 449a simulation was designed and synthesized, was dissolved into two different concentrations as 10 and 20 mg/mL. The expression of miRNA- 449a in lung cancer tissues and matched normal tissues were detected by Real time PCR. The expression of luciferase gene was detected by chemiluminescence technique. MiRNA- 449a mimics on cell apoptosis was evaluated by MTT assay. Results The mean tissues expression levels of miRNA- 449a in squamous carcinoma group and adenocarcinoma group were 1.48±1.63 and 1.52±1.54 respectively, and were significantly lower than in control group(2.74±1.55)(P<0.01). The average intensity of fluorescent protein in 10 mg/mL group and 20 mg/mL group were 2 115±168 and 1 352±159 respectively, and were significantly lower than that in control group(4 975±115)(P<0.01). Conclusions MiRNA- 449a was down-regulated expression in lung cancer and induced apoptosis.

lung neoplasms; miRNA- 449a; tumor biomarker; polymerase chain reaction; fluorogenic quantitative

2014- 06- 20

2014- 08- 25

廣西自然科學基金(2011GXNSFA0198215)

1001-6325(2015)01-0044-04

R961

A

*通信作者(corresponding author)：dengyb75@163.com