大鼠腦缺血后Notch分子上調調控血管新生

婁遠蕾，匡助才，魯友明，張愛軍，鄧志鋒,*，汪 泱,3*

(南昌大學 1.第一附屬醫(yī)院 泌尿外科研究所； 2.第二附屬醫(yī)院 神經外科， 江西 南昌 330006； 上海交通大學 附屬第六人民醫(yī)院 3.四肢顯微外科研究所； 4.神經外科， 上海 200233)

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大鼠腦缺血后Notch分子上調調控血管新生

婁遠蕾1，匡助才2，魯友明4，張愛軍4，鄧志鋒2,4*，汪 泱1,3*

(南昌大學 1.第一附屬醫(yī)院 泌尿外科研究所； 2.第二附屬醫(yī)院 神經外科， 江西 南昌 330006； 上海交通大學 附屬第六人民醫(yī)院 3.四肢顯微外科研究所； 4.神經外科， 上海 200233)

缺血性腦卒中是臨床常見疾病，腦缺血發(fā)生后，神經細胞發(fā)生變性及壞死，可導致嚴重的神經功能缺損，盡快恢復缺血區(qū)血供是治療缺血性腦卒中的關鍵。研究顯示腦缺血后缺血區(qū)域有代償性血管新生現象，它們對于增加腦缺血區(qū)血液灌注量和限制缺血半影區(qū)面積的擴散具有積極作用[1]，揭示腦缺血后血管新生的分子機制，有助于為臨床尋找新的治療靶點。Notch信號通路在胚胎期血管發(fā)育和腫瘤血管形成中發(fā)揮重要作用[2]，但它是否參與調控成體腦缺血后缺血皮質區(qū)微血管新生，尚不清楚。本研究觀察大鼠腦缺血后Notch信號分子的變化及其與缺血皮質區(qū)血管新生的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑：清潔級7～9周齡雄性SD大鼠伴質量250～280 g [南昌大學醫(yī)學院動物實驗中心SYXK(贛)2010- 0002]。Notch1抗體(CST和Millipore公司)，Hes1抗體、Ⅷ因子抗體、FITC標記的抗羊IgG和TRITC標記的抗兔IgG(Santa cruz公司)，ECL化學發(fā)光試劑盒(Pierce公司)。

1.2 局灶性腦缺血大鼠模型的制作及分組：參考文獻[3]制作大鼠大腦中動脈栓塞缺血損傷模型。模型成功的標志為右側出現Horner’s征和左側肢體神經功能缺損。將造模成功的大鼠隨機分組，每組各5只，分別于再灌注后8 h、1和3 d 處死動物。以假手術組作為對照組。

1.3 蛋白免疫印跡：心臟灌注后游離出腦組織，提取皮質區(qū)組織蛋白。取30 μg總蛋白經電泳分離后轉移至硝酸纖維素膜，分別加稀釋后大鼠抗Notch1和羊抗Hes1，4 ℃過夜。加HRP標記的抗大鼠IgG和抗山羊IgG，室溫1 h，ECL 檢測雜交信號。以β-actin蛋白作為內參，通過Image J 軟件對各組蛋白的表達進行半定量分析。

1. 4 免疫熒光組織化學染色：心臟灌注、取腦和固定，以8 μm作連續(xù)冰凍切片。

分別滴加小鼠抗Notch1和兔抗Ⅷ因子，37 ℃ 2 h。加FITC標記的羊抗小鼠IgG和TRITC標記的牛抗兔IgG，室溫1 h。PBS漂洗后50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果

2.1 缺血損傷激活腦組織Notch1分子：缺血1 d后腦組織活化Notch1蛋白(NICD)顯著上調，缺血第3天表達量進一步升高(P<0.05)。缺血1和3 d，Notch1分子的靶基因Hes1蛋白的表達趨勢與NICD一致(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with control圖1 腦缺血后皮質區(qū)NICD及Hes1蛋白的表達Fig 1 Protein expression of NICD and Hes1 after cerebral ischemia

A.sham control; B.8 hours after ischemia; C.1 day after ischemia; D.3 days after ischemia

2.2 Notch信號途徑參與腦缺血后血管新生的調控：正常腦組織中Vlll因子陽性細胞(TRITC標記)未觀察到有NICD(FITC標記)的表達(圖2A)，腦缺血再灌注1 d后缺血皮質區(qū)內有少量內皮細胞表達NICD(圖2C)，腦缺血3 d表達NICD的內皮細胞數明顯增加(P<0.05)(圖2D)，腦缺血8 h無明顯雙染陽性細胞(圖2B)。

3 討論

血管新生是指在原有血管的基礎上內皮細胞增殖、遷移和重塑形成新血管的過程，涉及諸多生長因子和信號通路分子。Notch通路主要由Notch受體、配體及靶基因組成，它決定著細胞的分化和組織的發(fā)生。當配體與受體結合后Notch分子活化，釋放受體胞內段活性結構域(NICD)，啟動Notch下游靶基因Hes1等的轉錄而發(fā)揮調控作用，Notch通路激活是血管發(fā)生和功能血管最終形成的重要調控因素[4]。

本研究顯示腦缺血后腦組織缺血皮質區(qū)NICD蛋白的表達明顯上調，提示Notch通路參與了腦缺血后的病理生理過程。本文采用免疫熒光雙重染色，觀察到腦缺血3 d缺血皮質區(qū)血管內皮細胞中NICD蛋白的表達較對照組顯著上調，提示Notch信號通路參與了腦缺血后血管新生過程的調控。Notch1分子靶基因Hes1蛋白在腦缺血1 d后明顯上調，缺血第3天仍有較高水平表達，表明Notch1可能通過上調其靶基因Hes1蛋白參與了腦缺血后微血管新生的調控，其具體機制還需更深入分析。

[1] Beck H, Plate KH. Angiogenesis after cerebral ischemia [J]. Acta Neuropathol,2009, 117: 481- 96.

[2] Kofler NM, Shawber CJ, Kangsamaksin T,etal. Notch signaling in developmental and tumor angiogenesis[J]. Genes Cancer, 2011,2:1106- 1116.

[3] Ma J, Zhao L, Nowak TS Jr. Selective, reversible occlusion of the middle cerebral artery in rats by an intraluminal approach. Optimized filament design and methodology [J]. J Neurosci Methods, 2006, 156: 76- 83.

[4] Gridley,T. Notch signaling in the vasculature[J].Curr Top Dev Bio, 2010, l92: 277- 309.

2014- 02- 12

2014- 06- 30

國家自然科學基金(81272170，81060324);江西省教育廳基金(GJJ11311)

1001-6325(2015)01-0097-02

R743

A

*通信作者(corresponding author)：wangy63cn@126.com；dengzf63@126.com