CagA+H.pylori對肝癌HepG2細胞增殖及TβRI、SMAD4和SMAD7表達的影響

劉 麗，黃贊松,*，黃衍強，周喜漢，尹毅霞，覃月秋

(1.廣西醫科大學 研究生學院2011級12班， 廣西 南寧 530021； 右江民族醫學院 2.消化疾病研究所 附屬醫院 消化內科；3.微生物免疫學教研室， 廣西 百色 533000)

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CagA+H.pylori對肝癌HepG2細胞增殖及TβRI、SMAD4和SMAD7表達的影響

劉 麗1，黃贊松1,2*，黃衍強3，周喜漢2，尹毅霞2，覃月秋2

(1.廣西醫科大學 研究生學院2011級12班， 廣西 南寧 530021； 右江民族醫學院 2.消化疾病研究所 附屬醫院 消化內科；3.微生物免疫學教研室， 廣西 百色 533000)

肝癌病因復雜，有研究發現幽門螺桿菌 (Helicobacterpylori,H.pylori)與肝癌相關，機制未明。CagA是H.pylori的毒力因子， CagA+H.pylori與肝癌可能有聯系。TGF-β(transforming growth factor beta, TGF-β)/Smads信號通路任何環節異常，均會造成腫瘤始動。TGF-β信號傳導依靠TβR及Smads，本實驗主要探討CagA+H.pylori對肝癌細胞的作用及對TβRI、SMAD4和SMAD7表達的影響，為研究CagA+H.pylori在肝癌發病機制中的作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞: 人肝癌HepG2細胞(中科院上海細胞庫)培養于含10%胎牛血清(Gibico公司)的改良型1640培養基(Hyclone公司) (簡稱培養液)，置飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.2H.pylori: 參照文獻[1]鑒定CagA+H.pylori，培養后收集，紫外分光光度儀檢測濃度，將菌液調整為1.0×106CFU(菌落形成單位，colony formation unit)/mL后連續5次10倍稀釋， 1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102和1.0×101CFU/mL。

1.3 MTT法檢測細胞增殖情況:用MTT法檢測CagA+H.pylori作用24 h對細胞增殖的影響，計算公式：增殖率(PI)=(實驗組A值-對照組A值)/對照組A值×100%(表2)。

1.4 CagA+H.pylori與細胞孵育:細胞調整為1×106個/mL，接種到培養瓶，置飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h后換無血清的培養液同步化處理24 h，各瓶加上述不同濃度CagA+H.pylori，每個濃度重復3次，作用24 h。陰性對照組不加CagA+H.pylori，加等量培養液。

1.5 RNA提取及反轉錄反應:用Trizol試劑提取總RNA。按Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser (perfect real time)反轉錄試劑盒(TaKaRa公司)說明書制備cDNA。

1.6 目的基因擴增:按super real premix plus(SYBR Green)熒光定量預混試劑增強版試劑盒(TianGen公司)說明書操作。計算公式:擴增倍數=2-△△CT。引物序列(表1)。

表1 引物序列

2 結果

2.1 CagA+H.pylori對HepG2細胞的作用:CagA+H.pylori在濃度1.0×101和1.0×102CFU/mL時促進細胞增殖，濃度為1.0×103、1.0×104、1.0×105和1.0×106CFU/mL時抑制細胞增殖，菌液濃度越高，抑制作用越明顯 (表2)。

2.2 TβRI、SMAD4和SMAD7 mRNA在HepG2細胞中表達水平:CagA+H.pylori濃度在1.0×101和1.0×102CFU/mL時抑制TβRI、 SMAD4表達， 促進SMAD7表達， 濃度為1.0×103、1.0×104、1.0×105和1.0×106CFU/mL時TβRI、SMAD4表達增加，SMAD7表達下調，菌液濃度越高，作用越明顯 (表3)。

表2 各組HepG2細胞增殖率比較

*P<0.05 compared with control group.

3 討論

研究表明CagA+H.pylori可誘導原癌基因表達升高，肝細胞動力學異常。CagA+H.pylori能干擾細胞增殖、凋亡，促進細胞產生炎性反應，在肝膽管型肝癌中可能起著重大作用[2]。許多腫瘤細胞或組織都有TβRI在mRNA或蛋白水平上的表達降低、缺失或突變，提示TβRI是在細胞膜發揮作用的抑癌基因。Smad4在腫瘤發病中表達下降或突變，從而不能發揮調控轉錄作用。Smad7可競爭結合TβRI，而抑制TGF-β1/Smads信號傳導，研究表明通過下調Smad7可抑制肝癌細胞生長[3]。本實驗證實CagA+H.pylori濃度在101和102CFU/mL時促進肝癌HepG2細胞增殖，抑制TβRI、SMAD4表達，促進SMAD7表達，濃度為103、104、105和106CFU/mL時抑制細胞增殖，TβRI、SMAD4表達增加，SMAD7表達下調，研究發現[2]低濃度的CagA+H.pylori能促進膽管細胞癌KKU-100細胞生長，而高濃度CagA+H.pylori抑制細胞生長，但目前尚未見CagA+H.pylori感染肝癌HepG2細胞后TβRI、SMAD4和SMAD7在肝癌細胞表達的實驗結果報道。據此我們推斷CagA+H.pylori可影響肝癌HepG2細胞增殖，表現為低濃度促進細胞增殖，高濃度起抑制細胞增殖作用，機制可能是通過影響TβRI、SMAD4和SMAD7的表達而起作用，確切的作用及機制需要更多的實驗和進一步研究證實。

表3 TβRI、SMAD4和SMAD7 mRNA相對定量

[1] 黃衍強,歐平,周喜漢,等.CagA+及VacA+幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥性突變分析[J].山東醫藥,2010, 50:37- 39.

[2] Boonyanugomol W, Chomvarin C, Baik SC,etal.Role of cagA-positive Helicobacter pylori on cell proliferation,apoptosis,and inflammation in biliary cells[J].Dig Dis Sci, 2011,56:1682- 1692.

[3] 范宜鋒,王文奇,白文坤,等.他莫昔芬對人肝癌HepG2細胞增殖和Smad7表達的影響[J].山東大學學報:醫學版,2009, 47:58- 60.

2014- 02- 07

2014- 05- 30

廣西自然科學基金 (0542119);廣西醫療衛生重點科研課題基金 (200887);廣西教育廳重點課題 (201202ZD078)

1001-6325(2015)01-0101-02

R575

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*通信作者(corresponding author)：huangzansong@hotmail.com