腎白寧對糖尿病腎病大鼠氧化應激的影響*

吳開明，常健菲，李顯筑，姚辛敏，黃吉峰

（1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江哈爾濱150036；3.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱150040）

隨著人們生活水平的日益提高，糖尿病（DM）發病率在世界范圍內呈逐漸上升趨勢，已成為重大公共健康問題[1]。糖尿病腎病（DN）是DM 嚴重的慢性微血管并發癥，嚴重影響患者的生活和生存質量，危及患者生命[2-3]。本課題組已針對糖尿病腎病的發病機制做了一些研究，本研究旨在觀察腎白寧對糖尿病腎病大鼠氧化應激的影響，為腎白寧治療糖尿病腎病提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物

清潔級SD 雄性大鼠60 只，5-6 周齡，體質量180～220g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司[許可證號SCXK（滬）2012-0005]。

1.2 藥品

腎白寧：由哈爾濱世一堂研究所配制成浸膏（當歸、熟地黃、山茱萸、山藥、牡丹皮、茯苓、澤瀉、黃芪、桑螵蛸、白花蛇舌草、水蛭等）；鹽酸貝那普利（洛汀新，北京諾華制藥有限公司，國藥準字：H20030514）。

1.3 試劑

鏈脲佐菌素（STZ）試劑盒購自美國Sigma 公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 模型制備與分組

將購買的SD 雄性大鼠，適應性喂養1 周，動物一般狀態良好，開始實驗。按體重將實驗動物隨機分為2 組，假手術組（A 組）12 只；DN 模型組48 只，行單側腎臟摘除手術，制備模型。術后恢復2 周后，DN 模型組實驗大鼠禁食12h，按照50mg/kg 劑量，予以1%STZ 溶液一次性腹腔注射；假手術組實驗大鼠腹腔注射等量的檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液。72h 后，尾靜脈采血，測空腹血糖。以空腹血糖水平≥16.7mmol/L 且穩定5d 作為DN 大鼠成模標準[4]。將造模成功的實驗大鼠隨機分為模型組（B組）、陽性對照組（C 組）、中藥組（D 組）。

2.2 給藥方法

中藥組將腎白寧浸膏溶于生理鹽水，配制成混懸液，予以2.97g·kg-1·d-1（含生藥量），2mL 混懸液灌胃；陽性對照組將鹽酸貝那普利溶于生理鹽水，配制成混懸液，予以中等劑量0.9mg·kg-1·d-1（按鹽酸貝那普利計），2mL 混懸液灌胃；模型組及假手術組予以等體積生理鹽水，每日1 次灌胃。連續給藥12 周。

2.3 觀察指標及檢測方法

分別于藥物治療的第4、8、12 周末，將大鼠置于清潔的代謝籠中，留取24h 尿液，測尿蛋白定量。于12 周末，禁食8h 后，以10%的水合氯醛溶液麻醉大鼠后剖腹，結扎右側腎臟，迅速取出右腎，用PBS 液將右側腎臟灌洗至發白，橫切分為兩部分，其中一部分放入凍存管中，迅速液氮冷凍，-80°C 冰箱保存，嚴格按照MDA、SOD 試劑盒說明書的操作步驟進行測定，并根據考馬斯亮藍法蛋白檢測試劑盒說明書方法，對蛋白含量進行測定。

2.4 統計學處理

采用SPSS17.0 統計軟件處理。常規進行方差齊性檢驗及正態檢驗，計量資料以（x±s）表示，計量資料兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用方差分析。檢驗顯著性水平設為P＜0.05。

3 結果

3.1 24h 尿蛋白定量情況

結果見表1，模型組、陽性對照組、中藥組在第4 周末時24h 尿蛋白定量明顯高于假手術組，差異具有統計學意義（P＜0.01），說明DN 動物模型制備成功。8 周末，與模型組比較，陽性對照組、中藥組24h 尿蛋白定量均明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與陽性對照組比較，中藥組24h 尿蛋白定量有下降趨勢，但差異無統計學意義（P>0.05）。12周末，與模型組比較，陽性對照組、中藥組24h 尿蛋白定量降低更加顯著，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與陽性對照組比較，中藥組24h 尿蛋白定量明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表1 腎白寧對大鼠24h 尿蛋白定量的影響（x±s）

3.2 腎組織MDA 及總超氧化物歧化酶（T-SOD）測定情況

結果見表2，與假手術組比較，模型組、陽性對照組、中藥組MDA 含量明顯升高，T-SOD 活性明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組、中藥組MDA 含量明顯降低，TSOD 活性明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與陽性對照組比較，中藥組MDA 含量降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表2 腎白寧對大鼠腎組織MDA 含量的影響（x±s）

4 討論

氧化應激（OS）是指體內自由基的產生與抗氧化防御之間失去平衡[5]，導致活性氧（ROS）在體內蓄積而造成的組織損傷，已經證實OS 是DM 多種慢性并發癥的各種不同發病機制的共同通路[6-7]。高糖通過ROS 可激活核轉錄因子-κB（NF-κB）[8]，啟動足細胞凋亡，影響腎臟正常功能的進行，導致腎臟纖維化，參與DN 的發生與發展[9]。故抑制ROS 的產生是防治糖尿病腎病的有效手段[10]。

MDA 為脂質過氧化產物，脂質過氧化作用通過鏈式或鏈式支鏈反應可放大ROS 的作用，引起細胞損傷，因此通過測定腎組織內MDA 的含量可間接反映腎臟脂質過氧化的程度[11]。機體還存在對抗ROS 的抗氧化應激防御機制，即酶抗氧化系統和非酶抗氧化系統，SOD 屬于酶抗氧化系統，能清除超氧陰離子自由基，是評價氧化應激的常用指標[12]。SOD 與MDA 常聯合檢測，共同反映細胞氧化應激程度[13]。高等動物細胞內SOD 有兩種，即銅鋅-SOD（CuZn-SOD）和錳-SOD（Mn-SOD），二者相加等于T-SOD，在CuZn-SOD 中Cu 是參與酶分子的活性中心結構，并在催化反應中傳遞電子；Zn 則不參與催化反應，但對活性中心結構有支持穩定作用。CuZn-SOD 主要存在于細胞漿中，Mn-SOD 主要存在于線粒體基質中，因此Mn-SOD 是線粒體的主要抗氧化酶[14]。以往研究已表明，黃芪及黃芪提取物具有良好的清除氧自由基，改善機體氧化應激的作用[15]，黃芪中所含的微量元素硒可以與體內SOD 結合，提高其活性，降低脂質過氧化物MDA 含量。

本實驗結果顯示，腎白寧可以明顯減少糖尿病腎病模型大鼠24h 尿蛋白排泄，降低腎組織中MDA含量，升高T-SOD 活性。提示腎白寧是通過減少高血糖引起的自由基的生成，發揮抗氧化應激作用，從而發揮腎臟保護作用。今后將進一步探究其抗氧化應激作用的具體機制。

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