五味子乙素通過NOS／NO 系統預防BaP所致HTR8-SVneo細胞氧化損傷

章艷燕，侯海燕，陳曉，梁婧，陳亞瓊

（武警后勤學院附屬醫院，天津 300162）

自由基大量堆積是造成細胞氧化損傷的主要原因。流行病學研究表明苯并（a）芘（BaP）在體內代謝過程中能產生大量氧自由基，造成細胞氧化損傷［1］。五味子乙素（Sch B）是五味子的提取物，可以誘導細胞的抗氧化反應［2］。本研究以人絨毛膜滋養層細胞HTR8-SVneo 為載體，探討一氧化氮合酶（NOS）／一氧化氮（NO）系統在Sch B 預防BaP 致HTR8-SVneo細胞氧化損傷中的作用及可能機制。

材料與方法

一、材料

1.細胞系：人絨毛膜外滋養層細胞系（HTR8-SVneo）由加拿大Graham 教授惠贈。

2.試劑：五味子乙素（Sch B）（中國藥品生物制品檢定所），苯并（a）芘（BaP）（Sigam，美國），RNA逆轉錄試劑盒（北京天根生化）、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）酶聯免疫分析試劑盒（上海藍基生物），NO 測試試劑盒、總一氧化氮合酶（TNOS）測定試劑盒（南京建成）。

3.儀器：MODEL680 型酶標儀（BIO-RAD，美國），水平電泳儀、垂直電泳儀及轉膜系統（北京六一儀器），電泳凝膠成像系統（FUGI，日本）。

二、研究方法

1.HTR8-SVneo 細胞培養和預處理：HTR8-SVneo細胞培養于含10%胎牛血清、120U／mL 青鈉霉素的RPMI1640培養基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱內。待細胞貼壁并長滿皿底85%左右時開始給藥。實驗分為3組，BaP組、Sch B 組和空白對照組。BaP組：先用僅含有10%胎牛血清的1640培養液培養6h，再更換至含有20μmol／L BaP的培養液中繼續培養24h；Sch B組：根據培養基中Sch B的濃度不同，又分為3組，各組先分別用含有不同濃度Sch B 的培養液（濃度分別為0.1、0.5 或2 μmol／L）培 養 細 胞6 h，再 換 成 含 有20μmol／L BaP的培養液繼續培養24h；空白對照組：用僅含有10%胎牛血清的1640培養液培養細胞6h，再更換為相同成分的培養液繼續培養24h。每組實驗重復3次。收集細胞制成細胞裂解液，同時將收集的細胞培養液離心待用。

2.MTS法檢測細胞存活率：選取對數生長期細胞接種于96孔板中，每孔100μl細胞懸液（含1×104個細胞），待細胞貼壁并長滿皿底85%左右時行如上預處理，BaP 孵育24h 后棄去藥物及培養液，每孔加入120μl MTS溶液，37℃孵育150min。使用MODEL680酶標儀選擇波長為490nm，檢測各孔的吸光光度值（OD），以空白對照組為參照，計算其平均值。

3.細胞培養液中NO 及TNOS含量檢測：采用還原酶法檢測細胞培養液中NO 及TNOS 含量。收集細胞培養液后離心，取上清，按照NO 測試試劑盒和TNOS測定試劑盒說明書步驟進行檢測。

4.細胞內誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、eNOS的mRNA水平檢測：利用Pubmed-Blast設計目的基因 引 物。iNOS 上 游 引 物 序 列：5’-CGGTGCTGTATTTCCTTACGAGGCGAAGAA-3’，下游引物序列： 5’-GGTGCTGCTTGTTAGGAGGTCAAGTAAAGG-3’；eNOS 上 游 引 物 序 列：5’-TCACATCTGTCCAGAGGCTG-3’，下游引物序列：5’-CTGGCACAGTCCCTTATGGT-3’；內參GAPDH 上游引物序列：5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3’，下游引物序列：5’-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3’。

細胞經藥物處理后，用Trizol法提取RNA 并逆轉錄為cDNA。對逆轉錄生成的cDNA 模板用iNOS、eNOS 引物進行RT-PCR 擴增，以GAPDH作為內參。RT-PCR 擴增體系（2×Tap PCR Master MIX 6μl，上游引物1μl，下游引物1μl，RNA底物1μl，ddH2O 3μl）。反應循環參數：95 ℃變性5min；95℃30s、56℃45s、72℃1min，共34個循環；最后72℃延伸10 min。取8μl擴增后產物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下進行成像分析，得到待測DNA 擴增產物與內參GAPDH 擴增產物的光密度值，計算二者的比值，即為目的DNA 的相對表達量。

5.細胞eNOS蛋白表達量測定：選取對數生長期細胞接種于6孔板中，每孔2ml細胞懸液（含5×105個細胞），待給藥處理后，按照eNOS 酶聯免疫分析試劑盒說明，吸取細胞培養液，離心5min后收集上清，酶標板上加樣，再加入酶標記溶液，37℃反應1h。棄液、洗滌5次，拍干。每孔依次加入顯色劑A 和顯色劑B，37℃避光顯色15min。每孔加入終止液，終止反應。置于酶標儀上450nm 測量各孔吸光光度值，重復測量3次。

三、統計學分析

采用SPSS 21.0 軟件進行統計分析。計量數據均以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、細胞存活率比較

BaP組細胞存活率（72.2±0.9）%明顯低于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；0.1、0.5或2 μmol／L Sch B＋20μmol／L BaP各組的細胞存活率分別為（78.2±1.5）%、（86.5±0.6）%、（93.4±1.0）%，顯著高于Bap組（P＜0.05）（圖1、2）。

圖1 光鏡下細胞生長圖片 ×200

圖2 各組細胞存活率比較

二、細胞NO 及TNOS含量比較

BaP組細胞培養液中NO、TNOS 含量分別為（4.21±0.20）μmol／L、（8.78±0.38）U／ml，均顯著高于空白組［分別為（1.82±0.15）μmol／L 和（6.08±0.68）U／ml］，差異有統計學意義（P＜0.05）；而與BaP 組相比，給予Sch B 干預的組別中NO、TNOS含量隨著Sch B 劑量的增加逐漸下降，0.1、0.5或2μmol／L Sch B＋20μmol／L BaP各組NO、TNOS含量分別為（3.90±0.18）μmol／L、（3.22±0.15）μmol／L、（2.81±0.15）μmol／L 和（7.51±0.55）U／ml、（7.45±0.48）U／ml、（6.19±0.50）U／ml（P＜0.05）（圖3）。

三、細胞內iNOS、eNOS mRNA 表達量

BaP組中iNOS、eNOS mRNA 表達量均高于空白組，分別為空白組的3.60和1.88倍，差異有統計學意義（P＜0.05），而與BaP 組相比，不同劑量Sch B 組 中iNOS、eNOS mRNA 表 達 量 均 顯 著 下降，分 別 為BaP 組 的0.80、0.49、0.50 倍 和0.71、0.73、0.57倍，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖4）。

四、細胞內eNOS蛋白表達量

eNOS酶聯免疫結果顯示，BaP 組中eNOS 蛋白表達量為（5.67±0.66）ng／ml，是空白組表達量［（3.16±0.86）ng／ml］的1.79倍（P＜0.05）；而與BaP組相比，不同劑量的Sch B 組中eNOS蛋白表達 量 顯 著 下 降，0.1、0.5 或2 μmol／L Sch B＋20μmol／L BaP各組eNOS蛋白含量分別為（4.34±0.39）ng／ml、（4.44±0.39）ng／ml和（3.20±0.88）ng／m，分別為BaP組的0.77、0.78和0.56倍（P＜0.05）（圖5）。

討 論

圖3 各組培養液中NO（A）、TNOS（B）含量比較

圖4 各組細胞內iNOS、eNOS的mRNA 相對表達量

圖5 各組細胞內eNOS蛋白表達量

多環芳烴類化合物是常見空氣污染物，大量研究表明多環芳烴類化合物可以通過胎盤屏障與胎兒血液中的血紅蛋白結合形成DNA 加合物，導致低出生體重、胎兒生長受限及出生缺陷等不良妊娠結局［3-4］。BaP是多環芳烴類污染物中最具代表性的一種，具有致畸、致癌、致突變作用。流行病學研究表明BaP在體內代謝過程中可以產生大量的氧自由基，對機體和組織細胞產生氧化損傷，造成組織細胞氧化應激反應。胚胎發育早期對環境致畸物較敏感，如果這一時期較多地暴露于Bap 甚至可導致胚胎發育停止［5-8］。

氧自由基誘導的細胞功能失調是胚胎體外發育受阻的一個重要因素，NO 就是其中之一。NO 作為一種自由基性質的生物活性氣體分子，普遍存在于機體各組織細胞中，具有非常重要的生理調節作用。近年來許多研究表明NO 在體內外早期胚胎發育中具有重要的調節作用。NO 代謝水平可作為檢測胚胎發育是否正常的一項重要指標［9］。NO 在組織和細胞中發揮其生物學作用的機理之一是通過激活鳥苷酸環化酶，引起環磷酸鳥苷（cGMP）水平升高。許多實驗證明cAMP／cGMP 比例對胚胎的生長發育和分化具有重要的調節作用［10］。NO 是cAMP／cGMP比例的主要調節者。故適量濃度的NO 是正常胚胎發育所必需，當其濃度失衡時則可能導致胚胎發育阻滯或胚胎死亡［11-12］。Fábregues等［13］的研究估計了NO 供體對小鼠胚胎體外發育和體內種植的研究，結果表明高濃度的NO 既能抑制小鼠胚胎的體外發育亦能抑制胚胎的體內種植。本研究結果表明BaP能刺激HTR8-SVneo細胞產生大量的NO，造成細胞損傷，而Sch B 能明顯減少NO 的生成，從而預防BaP對細胞產生的氧化損傷。

NOS是NO 合成過程中的限速酶，NOS 其同功酶主要有3 種亞型：eNOS、iNOS 和神經元型一氧化氮合酶（nNOS）。由于NO 半衰期非常短且極其不穩定，大多數關于NO 的研究都是以研究NOS的調控為基礎。大量研究表明NOS在許多哺乳類動物早期胚胎發育中均有不同程度的表達，在胚胎發育過程中起著重要作用。本研究結果顯示BaP組細胞培養液中TNOS含量明顯增加，而TNOS的活性增強能促進NO 的大量生成，致使高濃度NO對細胞產生損傷。而Sch B 能抑制TNOS 的大量增加，減少細胞損害。

流行病學研究表明正常妊娠期婦女整個妊娠期間羊膜及絨毛膜間質的纖維細胞均有iNOS表達，胎盤組織中亦有廣泛分布的iNOS，其與某些免疫因子相互作用，維持胎盤屏障的正常生理功能。iNOS生理狀態下處于不表達或低表達狀態，當機體受到急性損傷時，其表達被激活，產生過量NO 并聚積，高水平的NO 可損傷細胞線粒體、干擾能量代謝以及DNA 合成，還可使高劑量的超氧化物歧化酶（SOD）喪失保護作用，導致細胞死亡［14］。夏革清等［15］研究表明，iNOS表達與滋養細胞凋亡相關，在滋養細胞凋亡明顯的部位，iNOS的表達量增加，同時iNOS在自然流產滋養細胞中的表達水平明顯高于正常妊娠滋養細胞中的表達水平。Ogando 等［16］的研究亦表明，由iNOS 催化底物生成的高濃度NO 具有細胞毒性作用，引起胚胎損傷。同時還有研究表明可以通過抑制iNOS的表達降低NO 生成從而減少細胞損傷及凋亡［17］。本研究結果顯示，空白對照組細胞內iNOS mRNA 呈低表達狀態，而BaP組中iNOS mRNA 表達明顯上調，提示iNOS催化合成的過量NO 在BaP 對細胞產生的損傷中起促進作用。而不同劑量Sch B組中iNOS mRNA的表達量相比BaP組明顯減少，說明Sch B 可通過抑制iNOS的表達，減少NO 生成，減輕對細胞的損傷。

生理條件下內皮細胞在低表達eNOS催化下產生一定量的NO，通過細胞內cGMP 途徑調節平滑肌細胞的張力、舒張血管等。然而在某些條件下，如組織的缺血再灌注等過程中，eNOS 也能產生大量有損傷作用的NO［18］。許雅君等［19］研究表明乙醇能夠從基因和蛋白水平誘導胚胎組織eNOS表達的增加，繼而對組織造成氧化損傷，而乙醇導致胚胎細胞內NO 含量的增加可能也與eNOS的表達上調有關。本研究結果表明BaP 組eNOS mRNA 和蛋白水平的表達量均明顯增加，而Sch B 組中eNOS mRNA 和蛋白水平的表達量均顯著減少。進一步說明BaP可以通過上調eNOS活性，刺激細胞產生大量NO，從而對細胞產生氧化損傷，而Sch B 可以有效預防這種損傷。

綜上所述，BaP可能通過改變NOS活性，導致NO 代謝紊亂，誘發細胞的氧化損傷。Sch B則可以有效預防BaP所致的HTR8-SVneo細胞氧化損傷，其機制可能與NOS／NO 系統的平衡有關。

［1］ 連立芬，陳亞瓊，侯海燕.苯并芘的生殖毒性機制研究進展［J］.國際生殖健康／計劃生育雜志，2013，32：450-453.

［2］ 梁婧，侯海燕，蘭曉霞，等.五味子乙素的藥理作用及其分子機制的研究進展［J］.中國現代應用藥學，2014，31：506-510.

［3］ Madhavan ND，Naidu KA.Polycyclic aromatic hydrocarbons in placenta，maternal blood，umbilical cord blood and milk of Indian women［J］.Hum Exp Toxicol，1995，14：503-506.

［4］ Perera FP，Tang D，Rauh V，et al.Relationships among polycyclic aromatic hydrocarbon-DNA adducts，proximity to the World Trade Center，and effects on fetal growth［J］.Environ Health Perspect，2005，113：1062-1067.

［5］ Timme-Laragy AR，Van Tiem LA，Linney EA，et al.Antioxidant responses and NRF2in synergistic developmental toxicity of PAHs in zebrafish［J］.Toxicol Sci，2009，109：217-227.

［6］ Wu J，Hou H，Ritz B，et al.Exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons and missed abortion in early pregnancy in a Chinese population［J］.Sci Total Environ，2010，408：2312-2318.

［7］ 侯海燕，陳亞瓊，王丹，等.天津地區大氣顆粒物質與妊娠早期稽留流產的關系［J］.國際婦產科學雜志，2012，39：609-612.

［8］ Hou HY，Wang D，Zou XP，et al.Does ambient air pollutants increase the risk of fetal loss？A case-control study［J］.Arch Gynecol Obstet，2014，289：285-291.

［9］ 汪濤，劉宇，黃群山，等.一氧化氮對動物生殖機能的影響［J］.動物醫學進展，2006，27；27-30.

［10］ Dey SK，Kimura F，Mukherjee A，et al.Cyclic AMP and cyclic GMP in rabbit blastocysts［J］.J Reprod Fertil，1978，52：235-237.

［11］ Kim BH，Kim CH，Jung KY，et al.In volvement of nitric oxide during in vitro fertilization and early embryonic developpment in mice［J］.Arch Pharm Res，2004，27：86-93.

［12］ Sengoku K，Takuma N，Horikawa M，et al.Requirement of nitric oxide for murine oocyte maturation，embryo development，and trophoblast outgrowth in vitro［J］.Mol Reprod Dev，2001，58：262-268.

［13］ Fábregues F，Balasch J，Manau D，et al.Circulating levels of nitric oxide in successful and unsuccessful implantation after in vitro fertilization and embryo transfer.Relationship to ertradiol and progesterone［J］.Acta Obstet Gynecol Scand，2000，79：564-569.

［14］ 鄭楊.一氧化氮的生物化學及其生理和藥理效應［J］.化學教育，2000，2：1-5.

［15］ 夏革清，孫永玉.細胞凋亡與誘導型一氧化氮合酶在早期自然流產絨毛滋養細胞的表達［J］.生殖醫學雜志，2001，10：34-37.

［16］ Ogando DG，Paz D，Cella M，et al.The fundamental role of increased production of nitric oxide in lipopolysaccharideinduced embryonic resorption in mice［J］.Reproduction，2003，125：95-110.

［17］ Yang LY，Shen SC，Cheng KT，et al.Hispolon inhibition of inflammatory apoptosis through reduction of iNOS／NO production via HO-1 induction in macrophages［J］.J Ethnopharmacol，2014，156：61-72.

［18］ Matheis G，Sherman MP，Buckberg GD，et al.Role of Larginine-nitric oxide pathway in myocardial reoxygenation injury［J］.Am J Physiol，1992，262：H616-620.

［19］ 許雅君，李勇.乙醇對小鼠胚胎內皮型一氧化氮合酶表達影響［J］.中國公共衛生，2007，23：960-961.