CCDC40基因突變導致不動纖毛綜合征一例報道及文獻復習

文小艷，陳鵬，劉富華，鄭璨，韋曉蓮，侯顯良

（中國人民解放軍第一八一醫院中心實驗室，廣西代謝性疾病研究重點實驗室，桂林 541002）

一、病例資料

36歲的不吸煙的男性患者，自幼年患有反復呼吸道感染。婚后8年不育，就診于中國人民解放軍第181醫院的生殖醫學部；鼻竇部CT 示鼻竇炎，胸部CT 示支氣管擴張并感染，內臟反位（圖1）；患者的精子數量偏多（總數59.4×106），但活動力為零（前向運動與非前向運動精子均未見）；鼻粘膜活檢電鏡病例結果顯示：纖毛橫斷面見微管數目異常，內外動力臂缺失多見，且存在外周二聯體微管的內動力臂縮短或缺失的現象（圖2）。

圖1 胸部及腹部CT 照片

二、基因突變檢測

圖2 患者鼻粘膜活檢電鏡圖

為鑒定該患者的致病基因，我們采用外顯子測序技術對患者外周血單個核細胞中的DNA 序列進行分析。（1）基因組DNA 提取：患者及其父母的外周抗凝血按基因組DNA 提取試劑盒（Qiagen，德國）說明書進行。DNA 純度和濃度均在核酸定量儀（Eppendoff，德國）上檢測；（2）外顯子高通量測序：DNA 樣本送華大基因有限公司，應用NimbleGen SeqCap EZ Human Exome Library v2.0 試 劑 盒（Roche NimbleGen，美國）制備外顯子組文庫，使用Genome Analyzer：llx（Illumina，美國）測序系統對外顯子組區域進行高通量測序。整個樣品制備過程包括雜交文庫制備、雜交洗脫以及雜交后測序文庫制備，通過Genome Analyzer：llx測序系統獲得外顯子序列信息；（3）突變分析：使用SOAPsnp 軟件［1］檢測單核苷酸變異，使用SAMtools／GATK 軟件［1］分別檢測插入缺失，并用該軟件自帶腳本進行簡單過濾。應用現有的NCBI中單核苷酸多態性（SNP）數據庫（build135）和千人基因組計劃數據庫的資源，排除與母親樣品中不同的突變和健康人群中頻率大于1%的突變（下載自UCSC 的Common SNPs，http：／／hgdownload.soe.ucsc.edu／golden-Path／hg19／snp135Mask／），剩下的突變作為候選致病突變。共鑒定出該患者1 974個候選致病突變，包括1 670個SNPs和304個InDels。用SIFT 值評估一個氨基酸置換的預測結果，選取SIFT 值較高的突變，即有害的突變，對蛋白質功能有較大影響。查閱文獻，重點關注纖毛蛋白基因。最終我們鑒定了該患者的基因缺陷位點：CCDC40基因的一個雜合子突變位點（NM＿001243342.1：c.2609G＞A；p.R870H）；（4）突變位點驗證：使用Sanger測序分析了該CCDC40 基因的候選突變位點。采用Primer5.0軟件設計PCR 引物，其擴增片段橫跨患者突變所在位點，上游引物序列為：5’-GAGAGACAAAACCTGGCTCACCTCT-3’，下游引物序列為：5’-ACTCACTCTGCTTCCACCAGTTGAT-3’。測序后，該突變位點被驗證（圖3）。對100名正常人進行該突變位點的測序分析，結果未檢測到該位點純合或雜合突變（結果略），排除了該突變位點是多態性位點的可能性。

圖3 CCDC40突變區域的核苷酸序列驗證外顯子測序的結果

三、討論

人體分布有纖毛的結構在上下呼吸道、耳咽管、輸卵管等處。正常纖毛超微結構的橫截面由9個外周微管和2個中央微管組成，表現為“9＋2”的結構，它們之間通過內外動力臂，連接蛋白和輪輻連接（圖4）［2-3］。在正常情況下，呼吸道粘膜上的億萬個纖毛起著“清道夫”的作用，它們朝一個方向擺動，使吸入支氣管中的灰塵、細菌與呼吸道的細胞碎片及分泌的粘液一起排到喉頭，形成痰液咳出體外。不動纖毛綜合癥（PCD）就是一種少見的常染色體隱性遺傳病，由于纖毛結構異常或功能異常造成呼吸道粘膜的纖毛麻痹，纖毛粘液傳輸功能障礙，繼而導致慢性復發性化膿性肺部炎癥，鼻竇炎和中耳炎。由于纖毛結構缺陷的方式比較多，臨床上的表現輕重不一，臨床上如同時有支氣管擴張、鼻竇炎、內臟反位3聯征，則可診斷Kartagener綜合征。PCD 多在幼年發病，男女性發病率相同。據報道，發病率約為1∶15 000～1∶30 000［4］。但由于PCD 的漏診率較高，故實際發病率應大于上述數字。

原發性PCD 是由于纖毛結構和（或）功能缺陷引起多發性異常的遺傳性疾病（MIM 244 400）。到目前為止，國內外學者已經鑒定了導致該病的21個基因（表1）［1，5-15］，這些基因大多與內外動力臂的結構和功能有關［1，6，15］。有研究發現至少12%的PCD患者的內動力臂和微管排列存在異常，而該異常主要是由CCDC39和CCDC40基因突變造成的［9］。

CCDC40是進化過程中比較保守的含有卷曲螺旋結構域的蛋白，由1 142個殘基和預測的8個卷曲結構組成，對纖毛的運動至關重要。主要通過調節內動力臂和動力調節蛋白復合體的組裝來實現左右軸的形成。Becker-Heck等［13］對鼻咽深部黏膜上的纖毛進行高速視頻顯微鏡分析，以檢測CCDC40基因突變所致PCD 患者的纖毛運動的臨床特征。他們發現所有CCDC40基因突變所致的PCD 患者的纖毛擺動幅度顯著減小。在此基礎上，他們進一步闡明了該過程的分子機理：DNALI1-containing inner dynein arms和GAS11-containing DRCs這兩個軸絲復合物的正確組裝必須在CCDC40 的參與下才能完成。人類疾病中，CCDC40基因突變所致的PCD 疾病的特征是：中心微管對發生錯位，內動力臂和動力調節蛋白復合體組裝錯誤。另外，CCDC40基因在胚胎節點和中線，重要組織中特異性的表達控制左右軸的形成。在Becker-Heck等［13］的研究 中，68%的CCDC40 突 變 所 致 的PCD患者有內臟逆位的臨床表現。對此，“節點流假說”是目前廣泛被接受的能解釋內臟逆位現象的理論。

自從CCDC40基因被鑒定和發現其參與PCD疾病后，該基因的24個疾病相關的突變位點已被鑒定［9，13］。本研究通過外顯子組捕獲和第2代測序技術對1例PCD 患者進行基因突變檢測，并用Sanger測序證實檢測結果。發現該患者CCDC40 基因中有一個先前未被鑒定的突變位點（c.2609G＞A），改變了CCDC40蛋白序列，導致“9＋2”纖毛的超微結構缺陷（內動力臂和微管排列存在異常）。

圖4 正常纖毛超微結構的卡通圖（A）和電鏡圖（B）［2］

表1 基因突變導致人類PCD 疾病

過去數十年里，有關PCD 疾病致病基因的臨床研究和動物模型研究已經發現了很多有價值的纖毛基因。這些基因研究為纖毛的功能和結構組裝的分子機理以及左右軸線形成理論的進一步闡明提供了新的方向，更為開發新的方法以診斷、預防和治療PCD疾病提供契機。費前進等［16］對5例PCD 患者共行6個周期卵胞漿內單精子注射（ICSI）治療，取得較好的治療結果：受精率、卵裂率和優質胚胎率分別為50.0%、69.2%和55.6%，2例獲得臨床妊娠，1例生化妊娠，其中1例已分娩1 健康男嬰。表明ICSI是治療PCD 伴男性不育患者的一種有效的方法。然而，纖毛的結構過于復雜，在PCD 致病基因被完全認識前仍有大量工作要做。

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