利用AFLP構建棉花遺傳圖譜及纖維品質性狀QTL分析

王志偉 魏利民 謝曉美 吳立強 +張貴寅

摘要：利用AFLP分子標記技術，以陸地棉（Gossypium hirsutum L.）品種中棉所8號與海島棉（Gossypium barbadense L.）品種Pima90雜交產生的F2群體為材料，構建了包含11個連鎖群和86個標記位點（31個標記位點前人未曾報道）的連鎖圖譜，圖譜總長562.4 cM，約占棉花基因組的12.5%，標記間平均距離為6.5 cM。該圖譜有5個連鎖群被定位到相應的染色體上，6個連鎖群未定位于染色體上。應用復合區間作圖法分析F2單株和F2 ∶3家系的纖維品質性狀，檢測到11個與纖維品質有關的QTL，包括5個纖維長度（FL）、3個整齊度（FU）、1個馬克隆值（FM）、2個伸長率（FE）的QTL，分別解釋表型變異的17.7%～38.3%、16.3%～24.2%、24.7%、22.2%～46.5%。

關鍵詞：棉花；AFLP；遺傳圖譜；纖維品質；QTL

中圖分類號： S562.03 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0071-03

棉花是重要的天然纖維作物，棉花產業在國民經濟中占有重要的戰略地位。隨著社會進步和紡織技術的發展，對棉花纖維品質要求也在逐步提高。棉花纖維品質是數量性狀，纖維品質和產量性狀之間存在負相關，以傳統的育種方法同步改良產量和品質難度很大[1]。利用分子標記技術構建高密度的分子遺傳圖譜，定位控制數量性狀的基因，進行標記輔助選擇育種，可顯著提高育種效率。目前，在棉花中利用分子標記技術已經構建了多張遺傳圖譜[2-8]，在棉花產量及其構成因素、纖維品質、部分形態性狀方面進行了QTL定位研究[9-14]；但是不同研究標記順序、圖距、QTL數量、位置和效應等方面都存在較大差異，不利于遺傳圖譜和QTL的整合[4]。本研究以海島棉與陸地棉雜交F2群體為材料，利用AFLP分子標記技術，進行遺傳圖譜構建，并對纖維品質性狀進行了QTL分析，為分子標記輔助選擇育種提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以中棉所8號和海島棉Pima90為親本配制雜交組合，2008年在河北保定種植F1代并自交，2009年種植F2獲得145個單株，將F2單株自交獲得F2 ∶3家系，2010—2011年，在河北保定、青縣2地分別種植F2 ∶3家系。親本、F1、F2單株及F2 ∶3家系的纖維樣品，包括纖維長度、整齊度、馬克隆值、伸長率送農業部棉花品質監督檢驗測試中心測定。

1.2 棉花基因組DNA提取及引物篩選

棉花總DNA提取參考Zhang等改進的CTAB方法[15]。AFLP標記所用的EcoRⅠ+3和MseⅠ+3的引物各10個，分別為E32（AAC）、E33（AAG）、E35（ACA）、E36（ACC）、E37（ACG）、E38（ACT）、E40（AGC）、E41（AGG）、E57（CGG）、E71（GGA）和M47（CAA）、M48（CAC）、M49（CAG）、M50（CAT）、M59（CTA）、M60（CTC）、M61（CTG）、M62（CTT）、M71（GGA）、M82（TAT），隨機組配成100對不同的引物。參考Marnik等的反應體系和擴增程序[16]，用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染法檢測擴增產物。由上海生工生物工程有限公司合成所有引物。

1.3 遺傳圖譜的構建及纖維品質性狀的QTL分析

利用Mapmarker/EXP（Version 3.0）進行標記連鎖分析，LOD最小值取3.0，最大遺傳距離為50 cM，采用Kosambi函數構建遺傳連鎖圖譜。運用Windows QTL Cartographer 2.5軟件的復合區間作圖法[17]，檢測QTL的最低LOD值為2.5。QTL作用方式按Stuber等的標準[18]判定。利用繪圖軟件MapChart2.1繪制連鎖圖譜與QTL分布圖。

2 結果與分析

2.1 親本及纖維品質性狀分析

對親本和F2 ∶3家系纖維品質性狀數據進行統計分析（表1），中棉所8號的馬克隆值與伸長率明顯高于海島棉 Pima90，而纖維長度低于Pima90，雙親纖維品質的差異為構建遺傳圖譜和QTL定位奠定了基礎。4個纖維品質性狀在F2 ∶3家系群體中均呈連續分布，表明這些性狀屬于多基因控制的數量性狀。偏度和峰度的計算結果表明分離群體纖維品質相關性狀數據偏斜度絕對值均小于1，符合正態分布。纖維長度、馬克隆值和伸長率變異系數都在10%左右，說明這3個性狀在F2 ∶3家系間具有廣泛的遺傳變異。

2.2 AFLP引物的篩選及群體檢測

用雙親和F1的DNA對隨機組配的100對AFLP引物進行多態性篩選，共篩選出在親本中存在明顯多態性的引物20對，占篩選引物總數的20%，用這20對引物對F2群體進行檢測，共得到132個多態性標記?？ǚ綔y驗顯示，132個標記位點中有36個偏離孟德爾分離比例，占總標記的27.3%，定位到圖譜上12個。

2.3 連鎖圖譜的構建

對132個標記位點進行連鎖分析，構建的遺傳連鎖圖譜包括86個標記和11個連鎖群，最長的為135.4 cM，最短的為21.6 cM，標記間平均距離為6.5 cM，圖譜總長562.4 cM，約占棉花基因組的12.5%。通過對已構建的遺傳連鎖圖譜進行比對[2，7，9，13]，11個連鎖群中有5個連鎖群定位到了染色體上，分別是Chr.4、Chr.9、Chr.12、Chr.14、Chr.25，其余6個連鎖群沒有定位到染色體或亞組上，暫定為LG1～LG6（圖1）。

2.4 纖維品質性狀的QTL分析

通過復合區間作圖方法對棉花纖維品質性狀進行QTL定位分析，共定位11個與纖維品質性狀有關的QTL（表2），分布在Chr.4、Chr.9、Chr.12、Chr.25和LG1上。其中控制纖維長度的QTL有5個，位于Chr.9、Chr.12和Chr.25上，可解釋表型變異的17.7%～38.3%；控制整齊度的QTL有3個，位于Chr.12上，可解釋表型變異的16.3%～24.2%；只檢測到1個與馬克隆值相關的QTL，位于Chr.4上，可解釋表型變異的24.7%；檢測到2個與伸長率相關的QTL，位于Chr.9 和LG1上，可解釋表型變異的22.2%～46.5%。其中Chr.12上存在著2個纖維長度和整齊度的QTL重疊區間。

從|D|/|A|比值可知，5個纖維長度的QTL中，qFL1、qFL2、qFL3和qFL4均表現超顯性效應，qFL5表現為顯性效應；3個整齊度的QTL中，qFU1表現為顯性效應，qFU2和qFU3表現超顯性效應；馬克隆值的1個QTL表現超顯性效應；伸長率的2個QTLs，qFE1和qFE2均表現部分顯性效應。

3 討論

近年來，國內外報道的遺傳圖譜中，利用海陸棉花雜交群體，Lacape等以RFLP-SSR-AFLP構建了包含888個標記位點的圖譜[2]；Nguyen等以RFLP-SSR-AFLP構建了包含1 160個標記位點的圖譜[3]；Wang等利用陸陸雜交群體，以RAPD-SSR-AFLP-SRAP構建了包含132個標記位點的圖譜[5]。這些圖譜幾乎覆蓋異源四倍體棉花的全部基因組， 但是圖譜上空隙較多，利用AFLP標記較少，AFLP標記具有豐富的多態性，在基因組上均勻分布，可以充分填補圖譜上的空隙。通過與已有圖譜以及本實驗室已有結果進行比較[2-3，5，10，13]，本研究所構建的包含86個AFLP標記、11個連鎖群的遺傳圖譜，其中有31個標記前人未曾報道，為進一步填補圖譜空隙、構建飽和的高密度棉花圖譜奠定了基礎。

目前，在許多研究中發現控制棉花纖維品質性狀和產量性狀的QTL有成簇分布在染色體（連鎖群）上的現象。張培通等在LGD08染色體上檢測出了9個控制產量的QTL[1]；Wang等在A01、D2和D6染色體上檢測出成簇分布的棉花產量和纖維品質性狀的QTL[5]；He等在海陸雜交群體中發現，棉花重要經濟性狀成簇分布在A3、A8和D9染色體上[11]。本研究發現在Chr.12上qFL2和qFU2存在著重疊區間，qFL3和qFU3存在著重疊區間。這種現象表明，控制不同纖維品質性狀的基因可能緊密連鎖或一因多效，QTL可能會發揮其多重功能，一定程度上解釋了纖維品質性狀間的表型相關，但是這種現象是基因連鎖還是一因多效還有待進一步研究。

本研究檢測出的關于纖維品質性狀的QTLs中，有9個表現顯性和超顯性效應，顯性基因作用或者顯性與顯性基因的相互作用，對陸地棉和海島棉間進行漸滲雜交，有效轉移海島棉纖維品質優良基因提高陸地棉纖維品質能夠起到一定的作用。

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