水熱預處理工藝參數對玉米秸稈組分與酶解效率的影響

李梓木，于艷玲,，孫嘉星，李冬梅，馮玉杰

（1 哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150090；2 哈爾濱工業大學化工學院，黑龍江 哈爾濱 150001）

引 言

利用玉米秸稈等木質纖維素材料生產燃料乙醇具有減輕化石能源環境污染、保證能源安全、避免與人爭糧等優點[1-2]。由于木質纖維素材料中纖維素被木質素和半纖維素包裹纏繞且具有很高的結晶度[3]，纖維素直接酶解效率很低，通常不會超過20%[4]。因此，必須通過預處理解除半纖維素和木質素對纖維素的封閉，甚至瓦解纖維素的結晶結構，增加纖維素酶與纖維素的接觸面積，才能提高纖維素的酶解效率。

目前所應用的預處理方法中，稀酸預處理是木質纖維素預處理研究得最深入的方法，目前仍被很多人認為是最接近實用化的預處理技術，但是該方法對后續的酶解和發酵設備腐蝕嚴重，成為規模化應用的瓶頸之一[5-7]；蒸汽爆破方法對設備腐蝕小，但對設備要求高，處理效果不穩定[8]。水熱預處理（liquid hot water pretreatment）是利用高溫條件下（120～260℃）通過壓力將水保持在液態，但水的離子積增加、水呈現酸性的原理進行預處理的一種方法。在預處理過程中，半纖維素中的乙酰基不斷被水解為乙酸，乙酸作為催化劑與溶劑水共同催化半纖維素水解[9]。由于水在常溫條件下是中性的，因此水熱預處理同時兼具稀酸預處理和蒸汽爆破預處理的優點，是一種很有前景的木質纖維素預處理方法[10]。

水熱預處理反應裝置主要有間歇式和流動式兩種[11-12]。流動式水熱預處理能夠實時將半纖維素、木質素分解產物轉移到反應裝置之外，解除了產物抑制作用，以及在一定程度上避免木質素分解產物對反應的阻礙作用，但流動式水熱預處理對裝置要求較高，放大較困難，必須配備能夠提供較高壓力的輸液泵，制作成本較高。間歇式水熱預處理方法不能將半纖維素和木質素的分解產物實時轉移至裝置之外，但設備成本較低，易于放大。間歇式水熱預處理目前已應用于甘蔗渣[13]、柳枝稷[14]、大豆秸稈[15]、油菜秸稈[16]等原料。Yu 等[17]采用兩步法的間歇式水熱預處理桉木后進行酶解，第一階段水熱預處理在180℃下進行20 min，木糖得率為86.4%，第二階段200℃進行20 min，預處理后的纖維素酶解96.63%。Mosier 等[18]為減少木糖在酸性條件下分解采用控制pH 的間歇式水熱預處理方式控制單糖降解。Kim 等[19]通過200℃，15 min 的間歇式水熱預處理楊木，添加40 FPU·(g 纖維素)-1的纖維素酶使酶解率從未處理的3%提高到67%。Negro等[20]也以楊木為原料，設定230℃為反應溫度，溫度升高到反應溫度即將反應器冷卻至室溫以結束預處理，經酶解反應[纖維素酶添加量為15 FPU·(g底物)-1]獲得酶解率70%。

玉米秸稈是我國農業生產中剩余的一種重要生物質資源，年產量約為2.1 億噸，且具有不斷增長的趨勢[21-24]。不同產地玉米秸稈由于纖維素、半纖維素、木質素及抽提物含量具有差異，其水熱預處理的工藝條件也有所不同。多元線性回歸分析是建立在大量觀測值基礎上進行建模的較為有效和簡潔的統計學方法，目前尚無應用于水熱預處理的因素顯著性檢驗和模型構建的文獻報道。通過多元線性回歸分析不但能夠通過統計運算確定處理溫度和處理時間對半纖維素移除率等預處理結果影響的顯著性，還可以通過擬合模型對整個工藝條件范圍內，實驗設計未覆蓋到的工藝條件結果進行預測。本文應用間歇式水熱預處理產地為黑龍江的高抽提物含量玉米秸稈，對比預處理前后玉米秸稈主要成分（半纖維素，木質素，纖維素）的質量變化，并采用多元線性回歸分析處理溫度和處理時間對預處理效果的影響（方程擬合度不佳時改為二次方程擬合）。同時考察預處理之后纖維素酶解情況，探討預處理對纖維素酶解率的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

玉米秸稈（取自黑龍江省綏化市）經粉碎后全部過孔徑2 mm 篩，選取粒度為420～250 μm 的顆粒儲存于聚乙烯容器-20℃保存。玉米秸稈成分見表1。成分測定均采用美國可再生能源實驗室標準分析方法（National Renewable Energy Laboratory LAP standard analytical procedure）進行。所有測定實驗均進行兩次，表中數據為測定結果平均值。

表1 玉米秸稈組成成分Table 1 Composition of corn stover (dry mass basis)

1.2 處理溫度和處理時間對水熱預處理效果的影響

水熱預處理是在不銹鋼水熱合成反應釜(型號：316 L；內徑2.54 cm×不銹鋼厚0.165 cm，長度11.43 cm) 中進行。反應釜通過油浴（HH-S 油浴鍋）加熱。反應釜內添加3 g 秸稈（粒徑：420～250 μm，含水率4.4%）再加入27 ml 去離子水。反應釜溫度達到目標溫度時開始計時。通過將反應釜浸入室溫水中快速冷卻終止預處理。處理溫度范圍設定為180～220℃，處理時間范圍設定為10～25 min。預處理后的固液混合物通過抽濾分離，殘留固體以200 ml 熱去離子水(80～90℃)洗滌，35℃烘干24 h，保存于-20℃用于成分測定及酶解。

1.3 X 射線衍射分析

實驗儀器（德國Brucker D8-Advance 型X 射線衍射儀）采用Cu 靶，石墨單色器，加速電壓40 kV，電流40 mA，掃描步長0.02°，掃描速度0.075(°)·s-1，衍射角2θ的旋轉范圍為10°～30°。木質纖維素物料的相對結晶度CrI(%)通過下式計算[25]

式中，I002為校正后結晶區強度（2θ=22.5°）；Iam為校正后無定形區強度（2θ=18.7°）。

1.4 纖維素酶解實驗及酶解率測定

纖維素酶(Celluclast 1.5 L)和β-葡萄糖苷酶(Novozyme 188)購自Sigma 公司（中國，上海）。酶解實驗在含有40 μg·ml-1四環素和30 μg·ml-1放線菌酮的0.05 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.8)中進行。50 ml 酶解反應緩沖液，0.01 g 纖維素·(ml緩沖液)-1的酶解底物及纖維素酶和β-葡萄糖苷酶[兩酶用量均為15 U·(g 纖維素)-1]置于125 ml 錐形瓶，50℃，150 r·min-1，酶解72 h。酶解結束后取1 ml 酶解樣品10000 r·min-1離心5 min，上清液經0.22 μm 微孔濾膜過濾后放入-4℃冰箱保存待測。酶解率以原料秸稈中的纖維素質量為基準進行計算（不考慮固體得率），計算公式如下

預處理后固體葡萄糖得率考慮預處理后固體得率，以預處理后固體質量為基準進行計算，即每100 g 預處理后固體經酶解可獲得葡萄糖的質量，計算公式如下

1.5 分析方法

實驗中單糖及纖維素、半纖維素、木質素含量的測定依照美國可再生能源實驗室標準分析方法進行，應用具備示差檢測器的高效液相色譜（Shimadzu LC-10A）進行測定。色譜柱為 BioRad Aminex HPX-87P。色譜條件：去離子水為流動相，流速為0.6 ml·min-1，柱溫及檢測器的溫度設定為80℃。

1.6 統計分析

處理溫度和處理時間以及實驗結果（半纖維素移除率，木質素移除率，纖維素損失率）應用SPSS（21.0.0.0）進行多元線性回歸及方差分析或應用Design expert (8.0.6)進行模型擬合(模型擬合度不佳時)。選取200℃，10～25 min 以及180～220℃，20 min 為變量變化范圍，通過敏感性分析比較處理溫度和處理時間對評價指標（半纖維素移除率和纖維素損失率）的影響。木質素移除率受處理溫度和處理時間影響的敏感度大小通過擬合曲面進行分析。

2 實驗結果與討論

表2（數據均為平均值）中列出了不同條件水熱預處理后玉米秸稈的半纖維素移除率（以木糖計）、木質素移除率（以酸不溶木質素計）和纖維素損失率。半纖維素移除率（hemicellulose removal，HR）、木質素移除率（lignin removal，LR）和纖維素損失率（cellulose loss，CL）分別以原料秸稈的木聚糖、酸不溶木質素及纖維素質量為基準計算（不考慮固體得率），計算公式如下

HR=(原料秸稈中木聚糖質量-預處理后秸稈中木聚糖質量)/ 原料秸稈中木聚糖質量×100%

LR=(原料秸稈中木質素質量-預處理后秸稈中木質素質量)/ 原料秸稈中木質素質量×100%

CL=(原料秸稈中纖維素質量-預處理后秸稈中纖維素質量)/ 原料秸稈中纖維素質量×100%

2.1 水熱預處理工藝條件對秸稈中半纖維素移除的影響

從表2中可知，玉米秸稈中半纖維素移除率隨預處理條件的劇烈程度增大而增大，經210℃，25 min 水熱預處理后半纖維素移除率最大為86.0%。多元線性回歸分析獲得模型表達式為

殘差的正態p-p圖（圖1）顯示數據分布近正態分布適用于多元線性回歸分析，R2=0.953 說明模型擬合度較好。常數項和兩個自變量系數的顯著性均小于0.05，說明處理溫度(T)和處理時間(t)對半纖維素移除率的影響均為顯著。即在水熱預處理過程中，處理溫度和處理時間均能夠顯著促進半纖維素的自水解產生乙酸，催化半纖維素水解并溶解于水中，減少預處理之后固體中的半纖維素。另外，敏感度分析所選變量范圍內，T和t的敏感度系數分別為βtemperature=0.032 和βtime=0.0061，說明在該范圍內與處理時間相比，處理溫度的提高更能促進半纖維素的自水解，減少固體中的半纖維素。例如：經200℃，20 min 處理后半纖維素的移除率為61.2%；按5%的幅度提高預處理溫度至210℃后（210℃，20 min），半纖維素移除率提高到76.9%；而按25%的幅度延長預處理時間至 25 min 時（200℃，25 min），半纖維素移除率僅提高到74.8%。

圖1 半纖維素移除率多元線性回歸分析殘差的正態p-p 圖Fig.1 Normality p-p plot of residuals of hemicellulose removal multiple linear regression model

2.2 水熱預處理工藝條件對秸稈中木質素移除的影響

在所選實驗條件預處理后秸稈中的木質素質量均未降低，且在預處理溫度較高時木質素質量反而有所增加（表2）。其原因可能是部分纖維素和半纖維素在酸性條件下經過脫水、斷裂、重排、縮聚或聚合產生了酸不溶的物質。這些物質含有羰基、羧基、苯基及烴鏈等結構，在測定酸不溶木質素時常導致酸不溶木質素測定含量偏高，因此被稱為假木質素[26-29]。應用Design expert (8.0.6)軟件采取逐步法進行二次方程回歸分析，獲得R2=0.9283，p＜ 0.0001(significant)，Lack of fit=0.1381 (not significant) 的模型

表2 不同條件水熱預處理后秸稈中半纖維素移除率、木質素移除率、纖維素損失率和固體得率Table 2 Hemicellulose removal,lignin removal,cellulose loss and solid recovery after LHW pretreatment

模型中T和t的p值均小于0.0001，說明處理溫度（T）和處理時間（t）對木質素移除率（假木質素生成）均具有顯著影響。由圖2可知，在所選實驗范圍內，與處理時間相比處理溫度范圍內等高線較密集，擬合曲面坡度較大，變化趨勢較劇烈，說明處理溫度對結果影響更大。即雖然提高處理溫度和提高處理時間均能促進假木質素的生成，但提高處理溫度促進假木質素生成的作用更強。另外，從圖2中可以看到處理溫度低于200℃時（180℃和190℃），擬合曲面較為平緩，坡度變化較小且木質素增加量較少（表2）；處理溫度高于200℃時，擬合曲面坡度變化較大，等高線較密集且木質素增加量較多（表2）。這種現象可能是由于較高的溫度（≥ 200℃）更能促進部分纖維素和半纖維素的脫水、斷裂、重排、縮聚或聚合等化學反應生成酸不溶的物質（假木質素）。

圖2 木質素移除率方程的擬合曲面Fig.2 Fitting surface of lignin removal equation

2.3 水熱預處理工藝條件對秸稈中纖維素損失的影響

隨著預處理條件劇烈程度的增大秸稈中纖維素損失也隨之增大，經220℃、20 min 水熱預處理后纖維素損失率最大為15.3%（表2）。多元線性回歸分析獲得模型

模型p值為0.000，R2=0.818，殘差的正態p-p圖（圖3）顯示數據分布近正態分布適用于多元線性回歸分析。處理溫度(T)和處理時間(t)對半纖維素移除的影響均為顯著（顯著性均小于0.05）。敏感度分析所選變量范圍內，T和t的敏感度系數分別為βtemperature=0.17 和βtime=0.016。這說明處理溫度和處理時間均能夠促進秸稈中纖維素水解為葡萄糖，但相同幅度提高處理溫度更能促進纖維素的水解，造成纖維素的損失。方差分析顯示，處理溫度升高到200℃以上時（含200℃）各溫度間纖維素損失率差異（200℃以上時p=0.000 ＜ 0.05，180 和190℃時p=0.28 ＞ 0.05）開始顯著。從表2中也可以看出，經較低的溫度（180 和190℃）預處理后纖維素損失較少，但處理溫度和處理時間增大到一定值后，纖維素逐漸水解。這是由于與無定形的半纖維素相比，纖維素具有高度致密的結晶結構能夠保護自身不被水解。但處理溫度和處理時間增大到一定值（例如200℃、20 min）后，半纖維素自水解產生的乙酸等酸性物質不但催化半纖維素水解也能夠催化纖維素的水解。

圖3 纖維素損失率多元線性回歸分析殘差的正態p-p 圖Fig.3 Normality p-p plot of residuals of cellulose loss multiple linear regression model

2.4 X 射線衍射分析

玉米秸稈經水熱預處理后物料的X射線衍射圖譜如圖4所示，原料和預處理后樣品的衍射峰均在22.5°和16.3°為典型的纖維素圖譜。而在18.7°處的峰谷則代表了非結晶結構的組分。水熱預處理后玉米秸稈在22.5°處衍射峰強度有明顯提高，且峰形變尖，半峰寬有所減少，說明纖維素的結晶度有一定程度的提高。從結晶度上（表3）也可看到這種變化。與氨纖維爆破等[30]預處理不同，水熱預處理并不能破壞纖維素的結晶結構，隨著處理溫度和處理時間的增大結晶度反而有所增加（表3）。這是因為在水熱預處理過程中，無定形的半纖維素降解導致原料中纖維素比例增加。

圖4 玉米秸稈原料和水熱預處理后玉米秸稈的 X 射線衍射圖Fig.4 XRD spectra of untreated and liquid hot water pretreated corn stover

表3 玉米秸稈原料和不同水熱預處理條件下物料的結晶度Table 3 Crystallinity index of untreated and liquid hot water pretreated corn stover under different conditions

2.5 水熱預處理對秸稈纖維素酶解的影響

各條件預處理后的纖維素酶解率及預處理后固體葡萄糖得率如圖5所示。未經預處理玉米秸稈的纖維素酶解率僅為9.9%。水熱預處理顯著提高了玉米秸稈纖維素的酶解率，各條件水熱預處理后纖維素的酶解率均有不同程度的提高。經210℃、20 min 水熱預處理后玉米秸稈的纖維素酶解率最高為76.2%。預處理后固體葡萄糖得率趨勢與酶解率相似，同樣經210℃、20 min 預處理后固體葡萄糖得率最高為52.6 g·(100 g)-1。

210℃、20 min 預處理與酶解的質量平衡流程如圖6所示。100 g 玉米秸稈經210℃、20 min 預處理后獲得固體65 g，其中含有37.1 g 纖維素，酶解后獲得葡萄糖34.2 g。100 g 玉米秸稈經210℃、25 min 和220℃、20 min 預處理后固體中分別含有35.4 g 和34.2 g 纖維素，經酶解分別獲得32.6 g 和31.0 g葡萄糖。雖然210℃、25 min 和220℃、25 min 預處理后半纖維素移除率更高（表2），空間阻礙和反饋抑制[31]更小，預處理后剩余固體中的纖維素水解（以預處理后固體中纖維素質量計）也較多，但由于纖維素損失率較大（纖維素損失率分別為12.4%和15.3%），纖維素酶解率（以原料中纖維素質量計）和預處理后剩余固體葡萄糖得率均沒有獲得最高值。

水熱預處理增大纖維素酶解效率主要是通過水解半纖維素、減少纖維素酶的空間阻礙和半纖維素的反饋抑制來實現。從圖7中可以看出玉米秸稈的酶解率與預處理后半纖維素的移除率具有一定的線性關系（R2=0.8468）。半纖維素移除率越高，纖 維素酶解率也隨之升高。經水熱預處理的大豆稈及麥稈也具有相同的趨勢[32-33]。

圖5 各條件水熱預處理后纖維素酶解率及預處理后固體葡萄糖得率Fig.5 Cellulose digestibility and glucose yield in pretreated corn stover after liquid hot water pretreatment

圖6 玉米秸稈預處理與酶解過程質量平衡流程（預處理條件：210℃，20 min）Fig.6 Flow chart of mass balance during pretreatment and cellulose digestibility for corn stover (pretreatment condition:210℃,20 min)

圖7 半纖維素移除率與酶解轉化率的相互關系Fig.7 Correlation between cellulose digestibility and hemicellulose removal

3 結 論

（1）擬合模型分析顯示：處理溫度和處理時間對半纖維素移除率和纖維素損失率均具有正向顯著影響，對木質素移除率具有負向顯著影響。

（2）敏感度分析顯示：200℃、10～25 min 以及180～220℃、20 min 為變量變化范圍，處理溫度對半纖維素移除率和纖維素損失率的影響顯著性均大于處理時間。木質素移除率擬合曲面分析顯示：處理溫度對木質素移除率的影響顯著性大于處理時間。

（3）在所選實驗條件下，210℃、25 min 獲得最大半纖維素移除率86%，220℃、20 min 預處理后纖維素損失最大為15.3%，同時經220℃、20 min預處理后木質素測定質量增加最大為7.8%。

（4）210℃，20 min 水熱預處理后纖維素酶解率最高為76.2%，預處理后固體葡萄糖得率最高為56.2 g·(100 g)-1，提高處理溫度和延長處理時間能夠使半纖維素移除率進一步增加，但由于纖維素損失量增大導致纖維素酶解率和預處理后固體葡萄糖得率降低。

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