國外引進雙孢菇菌種與國內栽培菌種的RAPD和酯酶同工酶指紋圖譜分析

張欣倪　王鴻磊　丁強　呂蔚　鄒積華　崔從光　俞守能

摘要：利用RAPD和酯酶同工酶指紋圖譜對國內主栽的2個雙孢菇菌株及從荷蘭、美國引進的8個雙孢菇菌株進行親緣關系分析。結果表明，從47個RAPD引物中篩選了14個條帶清晰重復性好的引物，共產生了88條清晰的擴增條帶，其中多態性條帶64條，多態性位點百分率為72.73%，10個菌株可分為4個類群；酯酶同工酶電泳共擴增出了清晰條帶7條，其中多態性條帶6條，多態性位點百分率為85.8%，10個菌株可分為3個類群。2種技術均顯示，國內菌株與國外引進菌株之間親緣關系較遠。因此，引進國外優質雙孢菇菌株對增加中國雙孢菇遺傳多樣性具有重要作用。

關鍵詞：雙孢菇；酯酶同工酶；RAPD；親緣關系

中圖分類號： S646.032 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0254-03

雙孢菇（Agaricus bisporus）是中國廣泛栽培的一種中低溫性食用菌，近年來產量不斷增加。但是，中國的雙孢蘑菇品種之間遺傳關系較近[1]，且缺乏系統的歸類整理，導致中國目前市場上菌種的同種品種不同名稱，或者是不同品種同一名稱的混雜現狀，直接影響了中國雙孢菇菌種的生產、種質資源的保護和優良菌種選育。采用合理有效技術對雙孢蘑菇進行品種劃分，區分其品種親緣關系，鑒定雙孢蘑菇的品系顯得尤為重要。

RAPD技術是Williams研究小組提出的一種分子標記技術[2-3]。該技術通過人工合成的核酸單鏈（常為10個堿基）為引物，以試驗對象的DNA為模版，進行PCR擴增，產生一系列不同分子量的基因片段，不同引物的凝膠電泳結果，可以作為品系的遺傳特征進行記錄，用于品種鑒定。RAPD技術設備簡單，技術簡便易行，目前，已廣泛應用于不同物種的遺傳多樣性研究[4-9]。同工酶分子標記是從基因產物水平來研究生物的遺傳變異，是一種重要的分子遺傳標記技術[10]，酶帶的變化可作為鑒定物種，研究分類、進化、遺傳與變異的重要指標。自1959年Markert等提出酯酶同工酶概念后，酯酶同工酶標記技術在許多食用菌研究中得到了廣泛的重視和應用[11-14]。高分辨率的同工酶技術成為生化分類的主要方法之一[15]。

本研究利用RAPD和酯酶同工酶技術對中國的2個主栽雙孢菇菌株及從荷蘭、美國引進的8個優質雙孢菇菌株進行遺傳相似性分析，從分子水平上研究雙孢菇菌株之間的親緣關系和遺傳差異，為雙孢菇菌株的鑒定提供技術支持，同時為雙孢菇種質資源的引進及引進菌株在雙孢菇遺傳育種方面的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 （1）258、2796本實驗室保藏；（2）H901、HRLM、F3F、HA15引自荷蘭；（3）L901、5113、XXX、2200引自美國。

1.1.2 PCR試劑 RAPD引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成，Taq DNA 聚合酶、dNTP、DNA marker、Gelstain等購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.3 儀器設備 JY300C電泳儀：北京君意東方電泳設備有限公司生產；藍盾580可見光凝膠電泳透射儀：廈門致善生物科技有限公司生產；A200PCR儀：杭州朗基科學儀器有限公司生產；04S-3C全自動數碼凝膠圖像分析系統：北京君意東方電泳設備有限公司生產；3K30冷凍高速離心機：德國Sigma公司生產。

1.2 方法

1.2.1 RAPD分析 雙孢菇菌株利用PDA液體培養基[16]，24 ℃ 150 r/min 培養14 d，過濾收集菌絲體。菌絲體DNA提取采用CTAB法[17]。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，紫外分光光度計檢測 DNA濃度，稀釋至10 ng/μL，于-20 ℃冰箱中保存備用。PCR反應體系為15 μL，含1×PCR緩沖液、DNA模板 20 ng，dNTPs 200 mmol/L，引物0.3 μmol/L，TaqDNA聚合酶 1 U。PCR反應條件為：94 ℃預變性7 min；94 ℃變性1 min，退火1 min（退火溫度視引物而定），72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃延伸7 min，4 ℃終止反應。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓4 V/cm，Gelstain染色，凝膠成像系統觀察并照相。

1.2.2 酯酶同工酶分析 稱取0.5 g菌絲體，置于預冷的滅菌研缽中，加1 mL 樣品提取液，加少量滅菌石英砂，冰浴研磨，收集于1.5 mL離心管中。4 ℃ 10 000 r/min 離心5 min，將上清液、蔗糖溶液、溴酚藍溶液按5 ∶1 ∶1的比例混合，即為電泳樣品[18]。電泳分離膠濃度為7.5%，濃縮膠濃度為48%，電極緩沖液采用Tris-Gly系統，以1%溴酚藍作指示劑。電泳初始電流10 mA，待樣品進入分離膠后電流升至 20 mA，在0～4 ℃下電泳至溴酚藍指示劑距膠底1 cm停止電泳。用1%醋酸-1-萘酯、2%醋酸-2-萘酯和固藍RR鹽4 ℃染色15～30 min，用蒸餾水沖洗數次后置于乙酸溶液中固定，凝膠成像系統拍照[19]。

1.2.3 數據處理 利用NTSYSpc 2.10對電泳條帶進行分析，計算各雙孢菇菌株間的Nei氏遺傳相似性及遺傳距離，以平均連鎖法（UPGMA）進行聚類分析，得出聚類圖譜[20]。

2 結果與分析

2.1 雙孢菇菌株RAPD分析

利用47條引物對10個雙孢菇菌株進行了RAPD擴增，其中14條引物擴增出了清晰且具有多態性的條帶，共產生了清晰的擴增條帶88條，其中多態性條帶64條，多態性位點百分率為72.73%，結果見表1。

利用NTSYSpc 2.10計算菌株間遺傳距離，以平均連鎖法（UPGMA）對10個雙孢菇菌株進行聚類分析，構建10個雙孢菇菌株的親緣關系圖譜（圖1）。

從RAPD聚類圖（圖1）可見，8個引進菌株與2個國內主栽菌株的差異明顯，遺傳相似性只有0.53，在聚類圖上明顯分為2個分支。國內主栽的2個品種遺傳差異較小，相似性達到0933，可歸為1個類群。國外引進的8個菌株可分為3個類群，其中HRLM菌株與其他7個菌株差異較大，單獨歸為1個類群。引自美國的L901和引自荷蘭的F3F、HA15親緣關系較近，歸為1個類群，荷蘭菌株H901與美國菌株5113、2200、XXX歸為1個類群，這2個類群親緣關系較近，遺傳相似性接近0.88。

2.2 酯酶同工酶聚類分析

10個雙孢菇菌株酯酶同工酶圖譜見圖2，共擴增出了清晰條帶7條，其中多態性條帶6條，多態性位點百分率為85.8%。

利用NTSYSpc 2.10計算菌株間遺傳距離，以平均連鎖法

（UPGMA）對10個雙孢菇菌株進行聚類分析，構建10個雙孢菇菌株的親緣關系圖譜（圖3）。

10個不同品種雙孢蘑菇的酯酶同工酶電泳圖譜帶在位置、寬窄、濃淡以及數量等方面都體現出了一定的差異性。從圖譜上看，10個雙孢菇菌種分為3群，中國品種2796、258、荷蘭品種HRLM譜帶相同，荷蘭菌種H901、HA15、美國菌種L901譜帶相同，美國菌種5113、XXX、2200和荷蘭菌種F3F譜帶相同。中國品種與HRLM親緣關系較近，而其他引進品種間親緣關系較遠。

3 討論

中國是雙孢菇生產大國，但不是雙孢菇生產強國，菌種是制約中國雙孢菇產業發展最重要的因素之一。我國雙孢菇菌株親緣關系過于接近，影響我國雙孢菇育種等工作的順利開展。本研究結果表明，國外優質雙孢菇菌株與中國主栽菌株之間親緣關系較遠，為我國雙孢菇產業發展提供了一條新的思路。通過引進國外優質菌株，與國內菌株進行雜交育種，對提高中國雙孢菇遺傳多樣性、雙孢菇產量和抗病性等方面具有重要的作用。

同時，國外菌株在遺傳相似性方面也相對比較接近，在引種時要對引進菌株進行親緣關系檢測，避免菌株的重復引進。RAPD和酯酶同工酶電泳均可以反映菌株間的親緣關系[21]，而RAPD標記檢測的多態性要遠遠高于酯酶同工酶標記[22]，同時，當菌株親緣關系接近時酯酶同工酶酶譜與RAPD譜帶存在差異性。在實際應用過程中，應將二者有機結合起來，以獲得更加可靠的試驗結果。

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