紫外可見光譜法研究EGCG的穩(wěn)定性

李邦玉 吳媛 吳虹燕 劉臣

摘要：考察綠茶中表沒食子兒茶素沒食子酸酯在多種體系中的穩(wěn)定性。通過柱色譜分離純化綠茶中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）產(chǎn)品；采用紫外可見分光光度法定性研究溫度、時(shí)間、酸堿、紫外光、溶劑等對EGCG穩(wěn)定性影響，以及EGCG分別與H2O2、DPPH·的反應(yīng)。研究結(jié)果，溫度、時(shí)間、酸堿、紫外光等都不同程度影響EGCG穩(wěn)定性，紫外可見光譜跟蹤到了H2O2、DPPH·與EGCG的反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）；穩(wěn)定性；紫外可見分光光度法

中圖分類號：TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0294-03

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是綠茶所含兒茶素中含量最多的功能成分。因?yàn)楹卸鄠€(gè)酚羥基，EGCG具有很強(qiáng)的抗氧化活性，醫(yī)藥工業(yè)上應(yīng)用于抗菌、抗癌、抗衰老等治療，能夠改善癌細(xì)胞對化療的敏感性并減輕對心臟的毒性[1-3]。在食品工業(yè)中EGCG應(yīng)用于抗氧化、保鮮、祛臭等產(chǎn)品，日化工業(yè)中作特殊功能添加劑等[4]。但是在含茶葉的食品、藥品和飲料的加工和儲(chǔ)藏過程中，EGCG易受到溫度、金屬離子、酶和pH值等因素的影響，極易發(fā)生化學(xué)變化，從而改變了其原先的結(jié)構(gòu)和生物活性[5-7]。因此考察EGCG的穩(wěn)定性很有必要。本試驗(yàn)采用紫外可見分光光度法，定性研究不同環(huán)境條件下EGCG的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

EGCG對照品（南京廣潤生物制品，98%），DPPH·（Sigma 公司生產(chǎn)）、無水乙醇、30%過氧化氫、鹽酸、氫氧化鈉、己烷、乙酸乙酯、四氯化碳、三氯甲烷、甲醇，以上藥品皆為國產(chǎn)分析純試劑。綠茶為蘇州東山碧螺春茶廠提供。

紫外可見分光光度計(jì)：型號UV-1801；十萬分之一天平：CPA 225D；電熱恒溫水浴鍋；三用紫外分析儀：WFH-203，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；P230 型高效液相色譜儀：配有P230+紫外檢測器；P230/P230p高壓恒泵；EC2000 色譜工作站：大連依利特分析儀器有限公司生產(chǎn)；RUC-5200型超聲波清洗機(jī)：上海睿祺公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 EGCG的分離提純 取綠茶10 g，置于250 mL容量瓶中，加入95%乙醇150 mL，80 ℃超聲提取30 min，提取2次，合并提取液，過濾、80 ℃減壓回收乙醇，所得濃縮液上聚酰胺樹脂，以乙醇-醋酸梯度洗脫，薄層層析跟蹤檢測，收集EGCG部位流分，脫色、濃縮、重結(jié)晶，得EGCG純品，液相色譜法檢測產(chǎn)品成分與純度。

1.2.2 濃度對EGCG的影響 依次量取濃度為501.4 μg/mL EGCG儲(chǔ)備液 0.10、0.20、0.32、0.49、0.64 mL于25 mL的比色管中，添加無水乙醇至10 mL，配制濃度分別為8、12、16、24、32 μg/mL的梯度溶液，用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描。

1.2.3 溫度對EGCG溶液的影響 分別吸取濃度為 501.4 μg/mL EGCG儲(chǔ)備液2 mL于4支25 mL比色管中，添加無水乙醇至10 mL，制成同濃度的溶液，分別放入室溫、40、60、80 ℃溫度的水浴鍋中30 min，用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描。

1.2.4 時(shí)間對EGCG溶液的影響 分別吸取EGCG儲(chǔ)備液2 mL于5支比色管中，添加無水乙醇至10 mL，制成同濃度的溶液，將其中4支比色管放入80 ℃水浴鍋中，分別在1、3、5、7 h后掃描吸收曲線，剩下1支不加熱作為原液進(jìn)行對比。

1.2.5 紫外燈照射對EGCG溶液的影響 分別吸取2 mL EGCG儲(chǔ)備液于6支25 mL比色管中，添加無水乙醇至 10 mL，制成同濃度的溶液，將其中的5支比色管置于照射頻率為254 nm紫外燈下照射，照射時(shí)間分別為20、40、60、320、400 min，留1支比色管不照射紫外光作為對照，用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描。

1.2.6 pH值對EGCG溶液的影響 分別吸取0.5 mL EGCG儲(chǔ)備液于3支25 mL比色管中，再加入4 mL水，編號1、2、3，1號作為對照液進(jìn)行定性掃描，向2號比色管中逐滴加入010、0.25、0.40、0.55、0.70、0.85 mL鹽酸（0.01 mol/L），分別定性掃描后與原液對比；向3號比色管中逐滴加入0.1、02、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL氫氧化鈉（0.01 mol/L），分別定性掃描后與原液對比。

1.2.7 溶劑對EGCG溶液的影響 分別稱取EGCG 0.25 mg，轉(zhuǎn)入25 mL比色管中，分別加入水、己烷、乙酸乙酯、四氯化碳、三氯甲烷、甲醇、乙醇定容至25 mL，配制成濃度為10.0 μg/mL EGCG溶液，用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描。

1.2.8 H2O2與EGCG溶液的反應(yīng) 量取4 mL 0.1 mmol/L EGCG儲(chǔ)備液至25 mL比色管中，不斷滴加0.04 mol/L的過氧化氫溶液，連續(xù)掃描其紫外吸收光譜圖。

1.2.9 EGCG與DPPH·的反應(yīng) 量取4 mL 0.1 mmol/L EGCG儲(chǔ)備液至25 mL比色管中，不斷滴加0.1 mmol/L的 DPPH· 乙醇溶液，連續(xù)掃描其紫外吸收光譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜法檢測EGCG產(chǎn)品成分及含量

摸索得到的色譜分離條件為：色譜柱：Shimpak C18（4.6 mm ×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-冰醋酸（20 ∶80 ∶0.2）；檢測波長：280 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。純化的樣品及EGCG對照品色譜如圖 1、圖2。EGCG 純度大于97%。

2.2 濃度對EGCG溶液的影響

由圖3可知，EGCG在210、276 nm處都有吸收峰。從a到e，隨著EGCG溶液濃度升高，EGCG在276 nm處吸收峰位置不變且隨著EGCG濃度增大而逐漸升高，可以作為其特征吸收，只是濃度過低時(shí)不顯著。而在200～220 nm處吸收峰不穩(wěn)定，隨濃度增大而發(fā)生紅移，所以該處吸收不能作為其特征吸收。

2.3 溫度對EGCG溶液的影響

對4組100.2 μg/mL EGCG溶液，分別考察其在室溫、40、60、80 ℃的水浴鍋中加熱30 min后的變化，用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行定性光譜掃描。從圖4可以看出，隨著溫度的升高，EGCG溶液吸收曲線基本形狀沒有變化，只是吸收強(qiáng)度隨溫度的升高逐漸減弱，說明該濃度的EGCG溶液加熱時(shí)發(fā)生了部分降解，溫度越高降解程度越大。王靜等發(fā)現(xiàn)即使在0 ℃氧化2 min，EGCG的氧化程度也會(huì)達(dá)0.3[7]。

2.4 加熱時(shí)間對EGCG溶液的影響

從圖5可以看出，80 ℃下放置一段時(shí)間后，EGCG溶液吸收曲線大體形狀沒有改變，276 nm處特征吸收峰位置沒有變化，吸光度值隨放置時(shí)間延長而增大，1～5 h內(nèi)，吸收峰升高且趨于穩(wěn)定，而7 h后吸收強(qiáng)度再次大幅增加。276 nm處吸收強(qiáng)度增大應(yīng)該與EGCG濃度增大沒有關(guān)系，可能是其他類似物質(zhì)大量產(chǎn)生引起的。吳平等研究了不同溫度熱處理的EGCG，發(fā)現(xiàn)EGCG的氧化產(chǎn)物比較復(fù)雜，無法進(jìn)行定量分析[8]，有待進(jìn)一步研究。

2.5 紫外燈照射對EGCG溶液的影響

從圖6可知，EGCG經(jīng)一段時(shí)間紫外光照射后，其吸收曲線基本形狀沒有明顯改變，隨著照射時(shí)間延長，276 nm處特征吸收強(qiáng)度逐漸降低，可能是EGCG在紫外光照射下逐漸發(fā)生某種降解的緣故。

2.6 酸堿對EGCG溶液的影響

由圖7可知，EGCG溶液中加入不同量的鹽酸后，溶液顏色沒有變化，其光譜圖基本形狀也沒有明顯變化，從276 nm特征吸收處觀察，隨著加入鹽酸的量逐漸增多，276 nm處吸收強(qiáng)度降低幅度逐漸增大，但是總體幅度不大，說明EGCG在酸性體系中是相對穩(wěn)定的，隨著酸性增強(qiáng)穩(wěn)定性逐漸有所降低。陳利燕等將不同酸度（pH值分別為2.6、3.6、4.6、5.6）的兒茶素溶液在25 ℃放置18 h后，兒茶素的含量都有所減少，而EGCG是8種兒茶素組分中最穩(wěn)定的[6]。

向EGCG溶液中逐滴加入氫氧化鈉時(shí)，溶液由無色變?yōu)闇\橙色，且逐漸加深。從圖8可以看出，從b到j(luò)，EGCG體系中加入堿的量逐漸增大，EGCG光譜圖形發(fā)生明顯變化，在276 nm處的特征吸收峰隨著氫氧化鈉加入越來越弱，在 323 nm 附近產(chǎn)生了1個(gè)新吸收寬峰，并且隨著氫氧化鈉的進(jìn)一步加入，新吸收峰323 nm處強(qiáng)度越來越大。張玉艷等發(fā)現(xiàn)在堿性環(huán)境下，兒茶素酚羥基易與氫氧化鈉作用生成酚鈉，因此溶液呈現(xiàn)淡紅色，生成的苯氧基負(fù)離子使吸收波長紅移[9]。王靜等也認(rèn)為堿性條件有利于兒茶素B環(huán)上·OH的裸露，更易發(fā)生氧化聚合，導(dǎo)致堿性條件下EGCG反應(yīng)速率較快[7]。

2.7 溶劑對EGCG溶液的影響

EGCG在己烷、乙酸乙酯中不溶、在四氯化碳、三氯甲烷中稍溶，能溶于乙醇、甲醇和水中。EGCG的溶解度大小和溶劑的極性大小一致：水>甲醇>乙醇>乙酸乙酯>氯仿>四氯化碳>己烷，說明EGCG的溶解性隨溶劑極性的減小而降低。

從圖9可以看出，EGCG的特征吸收峰位置不隨溶劑變化而改變，且乙醇作為溶劑時(shí)，EGCG溶液在276 nm處的吸收峰最強(qiáng)。EGCG在不同溶劑中276 nm處吸收強(qiáng)度順序?yàn)椋核?甲醇<乙醇，這與三者的極性大小順序正好相反。在210 nm附近的吸收，隨溶劑乙醇、甲醇、水極性升高而藍(lán)移波數(shù)依次增加，且吸收強(qiáng)度逐漸減低。

2.8 H2O2與EGCG溶液的反應(yīng)

由圖10可知，從b到r，在EGCG溶液中，隨著H2O2加入量的不斷增加，EGCG溶液在276 nm處的吸光度逐漸降低，最后消失，說明EGCG的特征結(jié)構(gòu)已經(jīng)遭到破壞。

2.9 EGCG與DPPH·的反應(yīng)

從圖11可以看出，在EGCG溶液中滴加少量DPPH·后，EGCG的276 nm吸收峰位置和強(qiáng)度基本沒有變化，而 250 nm 以及300～500 nm處吸收峰隨著DPPH·的不斷加入，吸收強(qiáng)度呈逐漸升高，以至于EGCG的276 nm特征吸收峰相對強(qiáng)度逐漸降低。說明體系中生成了其他物種，使吸收帶復(fù)雜起來。

3 結(jié)論

采用紫外可見分光光度法定性研究了EGCG在不同體系中的穩(wěn)定性，初步跟蹤了EGCG與H2O2、DPPH·的反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)EGCG的穩(wěn)定性較差，溫度、紫外光照、持續(xù)受熱、酸堿條件、氧化劑和自由基等都會(huì)引起它的分解或轉(zhuǎn)化。EGCG與H2O2、DPPH·的反應(yīng)過程中紫外可見吸收光譜連續(xù)變化明顯。

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