紫外可見光譜法研究EGCG的穩定性

李邦玉 吳媛 吳虹燕 劉臣

摘要：考察綠茶中表沒食子兒茶素沒食子酸酯在多種體系中的穩定性。通過柱色譜分離純化綠茶中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）產品；采用紫外可見分光光度法定性研究溫度、時間、酸堿、紫外光、溶劑等對EGCG穩定性影響，以及EGCG分別與H2O2、DPPH·的反應。研究結果，溫度、時間、酸堿、紫外光等都不同程度影響EGCG穩定性，紫外可見光譜跟蹤到了H2O2、DPPH·與EGCG的反應。

關鍵詞：表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）；穩定性；紫外可見分光光度法

中圖分類號：TS201.2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0294-03

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是綠茶所含兒茶素中含量最多的功能成分。因為含有多個酚羥基，EGCG具有很強的抗氧化活性，醫藥工業上應用于抗菌、抗癌、抗衰老等治療，能夠改善癌細胞對化療的敏感性并減輕對心臟的毒性[1-3]。在食品工業中EGCG應用于抗氧化、保鮮、祛臭等產品，日化工業中作特殊功能添加劑等[4]。但是在含茶葉的食品、藥品和飲料的加工和儲藏過程中，EGCG易受到溫度、金屬離子、酶和pH值等因素的影響，極易發生化學變化，從而改變了其原先的結構和生物活性[5-7]。因此考察EGCG的穩定性很有必要。本試驗采用紫外可見分光光度法，定性研究不同環境條件下EGCG的穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

EGCG對照品（南京廣潤生物制品，98%），DPPH·（Sigma 公司生產）、無水乙醇、30%過氧化氫、鹽酸、氫氧化鈉、己烷、乙酸乙酯、四氯化碳、三氯甲烷、甲醇，以上藥品皆為國產分析純試劑。綠茶為蘇州東山碧螺春茶廠提供。

紫外可見分光光度計：型號UV-1801；十萬分之一天平：CPA 225D；電熱恒溫水浴鍋；三用紫外分析儀：WFH-203，上海精科實業有限公司；P230 型高效液相色譜儀：配有P230+紫外檢測器；P230/P230p高壓恒泵；EC2000 色譜工作站：大連依利特分析儀器有限公司生產；RUC-5200型超聲波清洗機：上海睿祺公司生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 EGCG的分離提純 取綠茶10 g，置于250 mL容量瓶中，加入95%乙醇150 mL，80 ℃超聲提取30 min，提取2次，合并提取液，過濾、80 ℃減壓回收乙醇，所得濃縮液上聚酰胺樹脂，以乙醇-醋酸梯度洗脫，薄層層析跟蹤檢測，收集EGCG部位流分，脫色、濃縮、重結晶，得EGCG純品，液相色譜法檢測產品成分與純度。

1.2.2 濃度對EGCG的影響 依次量取濃度為501.4 μg/mL EGCG儲備液 0.10、0.20、0.32、0.49、0.64 mL于25 mL的比色管中，添加無水乙醇至10 mL，配制濃度分別為8、12、16、24、32 μg/mL的梯度溶液，用紫外-可見分光光度計進行光譜掃描。

1.2.3 溫度對EGCG溶液的影響 分別吸取濃度為 501.4 μg/mL EGCG儲備液2 mL于4支25 mL比色管中，添加無水乙醇至10 mL，制成同濃度的溶液，分別放入室溫、40、60、80 ℃溫度的水浴鍋中30 min，用紫外-可見分光光度計進行光譜掃描。

1.2.4 時間對EGCG溶液的影響 分別吸取EGCG儲備液2 mL于5支比色管中，添加無水乙醇至10 mL，制成同濃度的溶液，將其中4支比色管放入80 ℃水浴鍋中，分別在1、3、5、7 h后掃描吸收曲線，剩下1支不加熱作為原液進行對比。

1.2.5 紫外燈照射對EGCG溶液的影響 分別吸取2 mL EGCG儲備液于6支25 mL比色管中，添加無水乙醇至 10 mL，制成同濃度的溶液，將其中的5支比色管置于照射頻率為254 nm紫外燈下照射，照射時間分別為20、40、60、320、400 min，留1支比色管不照射紫外光作為對照，用紫外-可見分光光度計進行光譜掃描。

1.2.6 pH值對EGCG溶液的影響 分別吸取0.5 mL EGCG儲備液于3支25 mL比色管中，再加入4 mL水，編號1、2、3，1號作為對照液進行定性掃描，向2號比色管中逐滴加入010、0.25、0.40、0.55、0.70、0.85 mL鹽酸（0.01 mol/L），分別定性掃描后與原液對比；向3號比色管中逐滴加入0.1、02、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL氫氧化鈉（0.01 mol/L），分別定性掃描后與原液對比。

1.2.7 溶劑對EGCG溶液的影響 分別稱取EGCG 0.25 mg，轉入25 mL比色管中，分別加入水、己烷、乙酸乙酯、四氯化碳、三氯甲烷、甲醇、乙醇定容至25 mL，配制成濃度為10.0 μg/mL EGCG溶液，用紫外-可見分光光度計進行光譜掃描。

1.2.8 H2O2與EGCG溶液的反應 量取4 mL 0.1 mmol/L EGCG儲備液至25 mL比色管中，不斷滴加0.04 mol/L的過氧化氫溶液，連續掃描其紫外吸收光譜圖。

1.2.9 EGCG與DPPH·的反應 量取4 mL 0.1 mmol/L EGCG儲備液至25 mL比色管中，不斷滴加0.1 mmol/L的 DPPH· 乙醇溶液，連續掃描其紫外吸收光譜圖。

2 結果與分析

2.1 液相色譜法檢測EGCG產品成分及含量

摸索得到的色譜分離條件為：色譜柱：Shimpak C18（4.6 mm ×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水-冰醋酸（20 ∶80 ∶0.2）；檢測波長：280 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量5 μL。純化的樣品及EGCG對照品色譜如圖 1、圖2。EGCG 純度大于97%。

2.2 濃度對EGCG溶液的影響

由圖3可知，EGCG在210、276 nm處都有吸收峰。從a到e，隨著EGCG溶液濃度升高，EGCG在276 nm處吸收峰位置不變且隨著EGCG濃度增大而逐漸升高，可以作為其特征吸收，只是濃度過低時不顯著。而在200～220 nm處吸收峰不穩定，隨濃度增大而發生紅移，所以該處吸收不能作為其特征吸收。

2.3 溫度對EGCG溶液的影響

對4組100.2 μg/mL EGCG溶液，分別考察其在室溫、40、60、80 ℃的水浴鍋中加熱30 min后的變化，用紫外-可見分光光度計進行定性光譜掃描。從圖4可以看出，隨著溫度的升高，EGCG溶液吸收曲線基本形狀沒有變化，只是吸收強度隨溫度的升高逐漸減弱，說明該濃度的EGCG溶液加熱時發生了部分降解，溫度越高降解程度越大。王靜等發現即使在0 ℃氧化2 min，EGCG的氧化程度也會達0.3[7]。

2.4 加熱時間對EGCG溶液的影響

從圖5可以看出，80 ℃下放置一段時間后，EGCG溶液吸收曲線大體形狀沒有改變，276 nm處特征吸收峰位置沒有變化，吸光度值隨放置時間延長而增大，1～5 h內，吸收峰升高且趨于穩定，而7 h后吸收強度再次大幅增加。276 nm處吸收強度增大應該與EGCG濃度增大沒有關系，可能是其他類似物質大量產生引起的。吳平等研究了不同溫度熱處理的EGCG，發現EGCG的氧化產物比較復雜，無法進行定量分析[8]，有待進一步研究。

2.5 紫外燈照射對EGCG溶液的影響

從圖6可知，EGCG經一段時間紫外光照射后，其吸收曲線基本形狀沒有明顯改變，隨著照射時間延長，276 nm處特征吸收強度逐漸降低，可能是EGCG在紫外光照射下逐漸發生某種降解的緣故。

2.6 酸堿對EGCG溶液的影響

由圖7可知，EGCG溶液中加入不同量的鹽酸后，溶液顏色沒有變化，其光譜圖基本形狀也沒有明顯變化，從276 nm特征吸收處觀察，隨著加入鹽酸的量逐漸增多，276 nm處吸收強度降低幅度逐漸增大，但是總體幅度不大，說明EGCG在酸性體系中是相對穩定的，隨著酸性增強穩定性逐漸有所降低。陳利燕等將不同酸度（pH值分別為2.6、3.6、4.6、5.6）的兒茶素溶液在25 ℃放置18 h后，兒茶素的含量都有所減少，而EGCG是8種兒茶素組分中最穩定的[6]。

向EGCG溶液中逐滴加入氫氧化鈉時，溶液由無色變為淺橙色，且逐漸加深。從圖8可以看出，從b到j，EGCG體系中加入堿的量逐漸增大，EGCG光譜圖形發生明顯變化，在276 nm處的特征吸收峰隨著氫氧化鈉加入越來越弱，在 323 nm 附近產生了1個新吸收寬峰，并且隨著氫氧化鈉的進一步加入，新吸收峰323 nm處強度越來越大。張玉艷等發現在堿性環境下，兒茶素酚羥基易與氫氧化鈉作用生成酚鈉，因此溶液呈現淡紅色，生成的苯氧基負離子使吸收波長紅移[9]。王靜等也認為堿性條件有利于兒茶素B環上·OH的裸露，更易發生氧化聚合，導致堿性條件下EGCG反應速率較快[7]。

2.7 溶劑對EGCG溶液的影響

EGCG在己烷、乙酸乙酯中不溶、在四氯化碳、三氯甲烷中稍溶，能溶于乙醇、甲醇和水中。EGCG的溶解度大小和溶劑的極性大小一致：水>甲醇>乙醇>乙酸乙酯>氯仿>四氯化碳>己烷，說明EGCG的溶解性隨溶劑極性的減小而降低。

從圖9可以看出，EGCG的特征吸收峰位置不隨溶劑變化而改變，且乙醇作為溶劑時，EGCG溶液在276 nm處的吸收峰最強。EGCG在不同溶劑中276 nm處吸收強度順序為：水<甲醇<乙醇，這與三者的極性大小順序正好相反。在210 nm附近的吸收，隨溶劑乙醇、甲醇、水極性升高而藍移波數依次增加，且吸收強度逐漸減低。

2.8 H2O2與EGCG溶液的反應

由圖10可知，從b到r，在EGCG溶液中，隨著H2O2加入量的不斷增加，EGCG溶液在276 nm處的吸光度逐漸降低，最后消失，說明EGCG的特征結構已經遭到破壞。

2.9 EGCG與DPPH·的反應

從圖11可以看出，在EGCG溶液中滴加少量DPPH·后，EGCG的276 nm吸收峰位置和強度基本沒有變化，而 250 nm 以及300～500 nm處吸收峰隨著DPPH·的不斷加入，吸收強度呈逐漸升高，以至于EGCG的276 nm特征吸收峰相對強度逐漸降低。說明體系中生成了其他物種，使吸收帶復雜起來。

3 結論

采用紫外可見分光光度法定性研究了EGCG在不同體系中的穩定性，初步跟蹤了EGCG與H2O2、DPPH·的反應。發現EGCG的穩定性較差，溫度、紫外光照、持續受熱、酸堿條件、氧化劑和自由基等都會引起它的分解或轉化。EGCG與H2O2、DPPH·的反應過程中紫外可見吸收光譜連續變化明顯。

參考文獻：

[1]仉燕崍，李 楠，韓國柱，等. 表沒食子兒茶素沒食子酸酯的研究進展[J]. 中草藥，2006，37（2）：303-306.

[2]朱發偉. 茶葉中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的研究進展[J]. 中草藥，2005，36（8）：1271-1272.

[3]葛 建，林 芳，李明揆，等. 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）生物活性研究進展[J]. 安徽農業大學學報，2011，38（2）：156-163.

[4]臧 鵬，屈維麗，于燕波，等. 表沒食子兒茶素沒食子酸酯在食品體系中的抗氧化作用研究[J]. 食品工業科技，2011，32（11）：361-363.

[5]陳惠衡，傅冬和，施 玲，等. 兒茶素穩定性試驗研究[J]. 食品研究與開發，2009，30（4）：10-12.

[6]陳利燕，屠幼英，陳 暄，等. 兒茶素在酸性環境中的穩定性研究[J]. 茶葉，2002，28（2）：86-88.

[7]王 靜，戚向陽. 表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯體外氧化影響因素及其氧化產物分析[J]. 精細化工，2006（11）：1094-1098.

[8]吳 平，夏 濤，高麗萍，等. 熱處理過程中表沒食子兒茶素沒食子酸酯變化的動力學研究[J]. 食品與發酵工業，2010，36（11）：34-39.

[9]張玉艷，沈生榮，唐德松，等. Cu2+與EGCG絡合作用的研究[J]. 浙江大學學報：農業與生命科學版，2004，30（3）：290-295.